第八章 发酵过程控制1-2

1、第七章第七章 发酵过程的代谢控制发酵过程的代谢控制发酵过程控制是发酵发酵过程控制是发酵的重要部分的重要部分控制难点：控制难点：过程的不确定性和参数的非过程的不确定性和参数的非线性线性同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果不同批次会得到不同的结果可见发酵过程的影响因可见发酵过程的影响因素是复杂的素是复杂的设备的差别、水的差别、培养基设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。代谢的不同。的一的一般方法对于控制代谢是十

2、分必要的般方法对于控制代谢是十分必要的第一节第一节 发酵过程工艺控制的发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次目的、研究的方法和层次一一 发酵过程的种类发酵过程的种类分批培养分批培养补料分批培养补料分批培养半连续培养半连续培养连续培养连续培养二二 发酵过程工艺控制的目的发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率最大的生产率发挥菌种的最大生产潜力考虑之点发挥菌种的最大生产潜力考虑之点 生长速率、呼吸强度、生长速

3、率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率营养要求（酶系统）、代谢速率 温度、温度、pH、渗、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能产物，而这些前体有可能流向不同的反应流向不同的反应方向方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。向进行。微生物代谢是一个复杂的系统，它的微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式代谢呈网络形式微生物的生长与产物合

4、成有密切相关性，微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性更具有复杂性因此对发酵过程的了解不能机械的，割因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从裂的去认识，而要从分子水平、细胞代分子水平、细胞代谢水平和反应工程水平谢水平和反应工程水平全面的认识全面的认识发酵过程受到多因素又相互交叉的发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如

5、影响如菌本身的遗传特性、物质运菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因输、能量平衡、工程因素、环境因素素等等。因此发酵过程的控制具有等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。不确定性和复杂性。 为了全面的认识发酵过程，本章为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些基本方面，在此基础上再举一些例子，说明例子，说明如何综合分析发酵过如何综合分析发酵过程及进行优化放大程及进行优化放大。三三 发酵过程研究的方法和层次发酵过程研究的方法和层次1、研究方法、研究方法单因子实验单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试：

6、对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验 一次可以进行多种条件的实验，可以在较一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。快时间内得到的结果。 如果考察的条件多，实验时间会比较长如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性性数理统计学方法数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、正交设计、均匀设计、响应面设计均匀设计、响应

7、面设计。 同时进行多因子试验。用少量的实验，经同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。大大提高了实验效率。 但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。较大的误差就会得出错误的结果。初级层次的研究初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的

8、组成、最适温长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适度、最适pH等要求。等要求。是工作量大，可以一次试是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。优化有较高的效率。2、研究的层次、研究的层次代谢及工程参数层次研究代谢及工程参数层次研究：一般在一般在。在在的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过

9、程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信所以得到的代谢情况比较可信。除了装备有除了装备有，得到发酵全过程的这些参数外，还有，得到发酵全过程的这些参数外，还有，更重要的是，有一套独特的，更重要的是，有一套独特的，可以得到，可以得到14个发酵过程参数，个发酵过程参数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过程的分析起到了重要的作用程的分析起到了重要的作用生产规模放大生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将在大

10、型发酵罐规模进行试验。将,达到产业化的实现。达到产业化的实现。一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成是不同的，原因可能是，罐的深度造成所致。所致。第二节第二节 发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分

11、析是生产控制的眼睛。判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为这些代谢参数又称为，因，因为它们反映发酵过程中菌的生理代为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如谢状况，如pHpH，溶氧，尾气氧，尾，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等气二氧化碳，粘度，菌浓度等物理参数：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产、产物浓度、核酸量等物浓度、核酸量等生物参数：生物参数：菌丝形

12、态、菌浓度、菌体比生长速率、菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等代谢参数按性质分可分三类：代谢参数按性质分可分三类：发酵过程参数直接参数直接参数: : 通过传感器把非电量变化直接转化为电量变化，实时地送计算机数据采集。 物理参数、化学参数、生物量参数 就地测量（in line）、在线测量（on line） 间接参数间接参数: : 由一些直接参数计算得到的各种反映过程特性的参数。 反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应器操作特性等。手工参数手工参数: : 取样后实验室手工测量参数，离线输入。 直接参数直接参数 物理参数物理参数

13、 化学参数化学参数成熟不成熟 间接参数从从检测手段分可分为：检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数、间接参数直接参数：直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、参数，如温度、pH、残糖等、残糖等间接参数：间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、摄氧率、KLa等等直接参数直接参数又可分为又可分为在线检测参数和离线检在线检测参数和离线检测参数测参数指不经取样直接从发酵罐上指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；、搅拌转速；指取出样后测定得到的

14、参数，指取出样后测定得到的参数，如残糖、如残糖、NH2-N、菌体浓度。、菌体浓度。一一 发酵过程主要分析的项目发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下目前发酵过程主要分析项目如下1、pH pH与微生物的生命活动密切相关与微生物的生命活动密切相关 酶催化活酶催化活性性 pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映的变化又是微生物代谢状况的综合反映基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况氧状况2、排气氧、排气、排气氧、排气CO2和呼吸熵和呼吸熵排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此

15、排气氧的大小反映了菌生长的活性，剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得通过计算可以求得。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。于消耗的氧。RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同

16、，值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料补料CERCER表示单位体积发酵液单位时表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量间内释放的二氧化碳的量呼吸熵呼吸熵OURCERRQ 呼吸熵反映了氧的利用状况呼吸熵反映了氧的利用状况对于这种工艺，对于这种工艺，是关键。过程中是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但发现，在补糖开始时，不但CERCER、OUROUR大幅度提高，连大幅度提高，连RQRQ也提高约也提高约1010，表明，表明通过补

17、糖不但提供了更多通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。一般在发酵中后期为保证产生次级代一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于谢产物，有意使菌体处于半饥饿状半饥饿状态态，在营养限制的条件下，维持产生，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。次级代谢产物的速率在较高水平。3、糖含量、糖含量菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来含量的测定，可以

18、控制菌体生长速率，可控制补糖来调节调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。不正常。微生物生长和产物合成与微生物生长和产物合成与有密切关系。有密切关系。反映产生菌的生长繁殖情况反映产生菌的生长繁殖情况反映产物合成的活力反映产物合成的活力糖的消耗：糖的消耗：糖含量测定包括总糖和还原糖糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。 还原糖还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。的是葡萄糖。

19、4、氨基氮和氨氮、氨基氮和氨氮氨基氮氨基氮指有机氮中的氮（指有机氮中的氮（NH2-N），单位是），单位是 mg/100ml。如。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮氨氮指无机氨中的氮（指无机氨中的氮（NH3-N）。）。氮利用快慢氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。况。但是但是氮源太多会促使菌体大量生长氮源太多会促使菌体大量生长。有。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控

20、制发酵过程，适时采取补氨措施。分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程否则影响提取过程5、磷含量、磷含量微生物体内微生物体内磷含量较高磷含量较高，培养基中以磷酸盐为，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是磷是核酸的组成部分核酸的组成部分，是高能化合物，是高能化合物ATP的的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。磷措施。菌形态

21、和菌浓度菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。直接反映菌生长的情况。菌形态菌形态 显微镜观察显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。合与否的一个参数。6、菌浓度和菌形态、菌浓度和菌形态菌浓测定方法菌浓测定方法测粘度测粘度压缩体积法（离心）压缩体积法（离心）静置沉降体积法静置沉降体积法光密度测定法光密度测定法 ODOD600660600660 适

22、合于细菌、酵母适合于细菌、酵母7、产物浓度、产物浓度 在培养过程中，产生菌的在培养过程中，产生菌的合成能力和产物合成能力和产物积累积累情况都要通过情况都要通过来了解来了解产物浓度产物浓度直接反映了生产的状况直接反映了生产的状况,是发酵控制的重是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成对产物形成的影响。的影响。二二 产物量的测定产物量的测定（一）（一） 产物量的特殊表示法产物量的特殊表示法1 1、抗生素效价的表示、抗生素效价的表示抗生素效价表示抗生素的有效成分

23、的抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（多少，效价大小用单位（U）来表示）来表示效价表示方法：重量折算法效价表示方法：重量折算法 重量单位重量单位 类似重量单位类似重量单位 特殊单位特殊单位重量折算单位：以最低抑菌浓度为重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素一个单位，如青霉素0.6微克微克1U重量单位：规定某些抗重量单位：规定某些抗生素活性部分生素活性部分1g=1u 如链霉素、卡那霉素、如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分红霉素等定义活性部分1g1u类似重量单位：规定抗生素的某类似重量单位：规定抗生素的某种盐种盐1mg=1000u如金霉素、四环如金霉素、四环素的盐

24、酸盐定一为素的盐酸盐定一为1g1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素制霉菌素 1mg=3700u多粘菌素多粘菌素B 1mg=10000u2 2、酶活力的表示法酶活力的表示法酶活力用单位来表示。由于酶通常不是酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。同一很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成混乱，为此国际上作了单位，容易造成混乱，为此国际上作了统一规定，规定在统一规定，规定在250C下，下，以最适的底以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及物浓度，

25、最适的缓冲液离子强度，以及最适的最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。克分子底物的酶定量为一个活性单位。（二）（二） 产物量的测定产物量的测定1 1、化学法、化学法（1）滴定法）滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法可用滴定法如青霉素在碱性条件下加入过量的如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生，反应生成青霉噻唑酸碘，用成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位可计算出青霉素的单位计算青霉素效价青霉噻唑酸碘青霉素滴定多余过量23222,IOSN

26、AIOH柠檬酸可以用柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量滴定来计算柠檬酸产量（2）比色法）比色法产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。产物浓度成正比，可以用比色法测定。蓝色麦芽酚链霉素加热，22,FeOHOH淀粉酶活力测定：在淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活处所得吸光度跟淀粉酶活力

27、成正比。力成正比。（3）测压法）测压法 产物特定反应放出或摄入气体，使系统产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。物量。2、物理法、物理法 许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。素的含量。谷氨酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶氨基丁酸氨基丁酸CO2化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析过程分析缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此缺点产品中

28、存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。抗生素成品的测定用生物法测定。 适用于抗生素效价的测定适用于抗生素效价的测定 生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。但此法得到结果比较慢，需经过能比的。但此法得到结果比较慢，需经过1618小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。定。3 3、生物法、生物法常用的生物法测定抗

29、生素，采用杯碟法常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法“杯杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为径为6mm，高，高10mm的圆筒形管子，管子的重的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每碟全融化，倒在培养皿内，每碟15ml（下层），（下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到500C左右混入试验菌，将混有菌的培养基左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml加到

30、加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。已凝固的培养基上待凝固（上层）。 在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在检样品，加满后在370C培养培养1618小时。在小时。在培养中培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫叫

31、“抑菌圈抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越。抗生素浓度越高，抑菌圈越大，大， r: 抑菌圈的半径抑菌圈的半径(毫毫米）米）M：抗生素在管中的：抗生素在管中的量（单位）量（单位）C：最低抑菌浓度：最低抑菌浓度（单位（单位/毫升）毫升）H：培养基的厚度：培养基的厚度（毫米）（毫米）L：管子的高度（毫：管子的高度（毫米）米）D：抗生素的扩散系：抗生素的扩散系数（毫米数（毫米/小时）小时）T：细菌生长到肉眼：细菌生长到肉眼所用的时间所用的时间 （小时）（小时）抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系关系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4DTH)抗生素的总

32、量的对数值与抑菌圈半径的抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受平方呈正比。此外还受C、H、D、T的的影响影响但是但是C、H、D、T是无法是无法测量的，在实际计算中要测量的，在实际计算中要设法消去设法消去一般的消去方法有一般的消去方法有l二剂量法二剂量法l标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法优点：在一个碟优点：在一个碟子上可以同时做子上可以同时做两个样品的效价，两个样品的效价，当要做的样品量当要做的样品量大时，采取标准大时，采取标准曲线法可以提高曲线法可以提高效率。效率。假设选用的浓度为：假设选用的浓度为：3U，4U，5U，6U,7U中心点是中心点是5U1122每个浓度做三个

33、碟每个浓度做三个碟子。子。5U为中心点，每个为中心点，每个碟子中有碟子中有3个杯中个杯中加中心点浓度，其加中心点浓度，其余余3个加其它浓度。个加其它浓度。测得抑菌圈后，将测得抑菌圈后，将浓度和抑菌圈平均浓度和抑菌圈平均直径做标准曲线。直径做标准曲线。logMr管碟法影响因素的讨论：管碟法影响因素的讨论：)4log()21. 91(log2DTHCrDTM斜率小斜率小 D、T大大,误差小误差小截距小截距小 C、D、T、H小，误差小，误差小小logMrlogM1r1r1r1l培养基厚度培养基厚度H越小，其它条件相同时越小，其它条件相同时r越大。越大。影响影响H的因素：培养基的厚度的因素：培养基的厚

34、度l细菌生长到肉眼所需的时间细菌生长到肉眼所需的时间T越大在其越大在其它条件相同时，它条件相同时，r越大越大影响影响T的因素：菌体本身，及影响菌体的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条件如：接种量，培养温度、及生长的条件如：接种量，培养温度、及营养环境营养环境其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的温度、钢圈的放置、滴液的温度、钢圈的放置、滴液1 1、 分批发酵分批发酵简单的过程，培养基中接入简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、排气。整个过程中菌的浓

35、度、营养成分的浓度和产物浓度营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。等参数都随时间变化。分批培养中微生物的生长分批培养中微生物的生长迟滞期迟滞期对数生长期对数生长期稳稳 定定 期期死亡期死亡期微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期稳定期和死亡期在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂

36、，这时细胞生到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期称为对数生长期随着细胞生长，培养液中的营养物随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期进入死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量物则在对数生长期后期和稳定期大量

37、合成。合成。分批培养的优缺点分批培养的优缺点优点优点 操作简单，周期短，染菌机会少，操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握生产过程和产品质量容易掌握缺点缺点 产率低，不适于测定动力学数据产率低，不适于测定动力学数据2 2、补料分批培养、补料分批培养 在分批培养过程中补入新鲜的料液，在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实比发酵开始时有所增加。在

38、工厂的实际生产中采用这种方法很多。际生产中采用这种方法很多。补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点优点优点 在这样一种系统中可以维持低的在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点缺点 由于没有物料取出，产物的积累最由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机

39、会加入增加了染菌机会3 3、半连续培养、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵品种采取这种方式，如四环素发酵优点优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。提高了总产量。缺点缺点 代谢产生的前体物被稀释，代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大提取的总体积增大4 4、连续培养、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出发酵过程中一边补入新鲜料液一边

40、放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。连续培养的优缺点连续培养的优缺点优点优点 控制稀释速率可以使发酵过程最控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由优化。发酵周期长，得到高的产量。由于于D，通过改变稀释速率可以比较容，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学易的研究菌生长的动力学缺点缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染引

41、起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。菌机会大大增加。第四节第四节 发酵过程的发酵过程的pHpH控制控制 pHpH是微生物代谢的综合反映，是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。十分重要的参数。发酵过程中发酵过程中pHpH是不断变化的，通过观察是不断变化的，通过观察pHpH变化规律可以变化规律可以了解发酵的正常与否了解发酵的正常与否1 1、基质代谢、基质代谢 特别是快速利用的糖，分解成小特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料上升，是补料的标志之一的标志之一 当氨基酸中的

42、当氨基酸中的-NH2被利用后被利用后pH会会下降；尿素被分解成下降；尿素被分解成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下下降，当碳源不足时氮源当碳源利用降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。上升。后后pH会上升或下会上升或下降降2 2、产物形成、产物形成 某些产物本身呈某些产物本身呈，使发酵液，使发酵液pH变变化。如有机酸类产生使化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。上升。 3 3、菌体自溶，、菌体自溶，pH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pH上升。上升。 pH对林可霉素发酵的影响对林可霉素发

43、酵的影响 林可霉素发酵开始，林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间葡萄糖转化为有机酸类中间产物产物，发酵液，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。上升。若若不及时补糖、不及时补糖、(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4或酸或酸，发酵液，发酵液pH可迅速可迅速升到升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵至停止。对照罐发酵66小时小时pH达达7.93，以后维持在，以后维持在8.0以上至以上至115小时，菌丝浓度降低，小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。升

44、高，发酵不再继续。发酵发酵15小时左右，小时左右，pH值可以从消后的值可以从消后的6.5左右下降到左右下降到5.3，调节，调节这一段的这一段的pH值至值至7.0左右，以后自控左右，以后自控pH，可提高发酵单位。，可提高发酵单位。1 1、实例、实例pH7.0t不调不调pH调调pH效价效价pH例：培养基初始例：培养基初始pHpH值对漆酶分泌的影响值对漆酶分泌的影响pH在在47范围内产酶最高范围内产酶最高2 2、pHpH对发酵的影响对发酵的影响 （1）pH影响酶的活性。当影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻的活性时使菌的新陈代谢受阻（2）pH值影响微生物细胞

45、膜所带电荷的改变，值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行行 （3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用解离，从而影响微生物对这些物质的利用 （4）pH影响代谢方向影响代谢方向 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产使代谢产物的质量和比例发生改变物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在时

46、发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生近中性时，则产生草酸。草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰乙酰谷氨酰胺胺3 3、pHpH在微生物培养的不同阶段在微生物培养的不同阶段有不同的影响有不同的影响 生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小对菌体生长影响比产物合成影响小例例 青霉素：菌体生长最适青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适产物合成最适pH7.27.4 四环素：菌体生长最适四环素：菌体生长最适pH6.06.8，产物合成最适，产物合成最适pH5

47、.86.0XpH四环素四环素4 4、最佳、最佳pHpH的确定的确定配制不同初始配制不同初始pHpH的培养基，摇瓶考察发酵情况的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响pHpH对海藻糖水解酶产生的影响对海藻糖水解酶产生的影响pH菌浓菌浓 pH酶活酶活pHpH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响对谷氨酰胺转氨酶活力的影响 1 1、调节好基础料的、调节好基础料的pHpH。基础料中若含。基础料中若含有玉米浆，有玉米浆，pH呈酸性，必须调节呈酸性，必须调节pH。若要控。若要控制消后制消后pH在在6.0，消前，消前pH往往要调到往往要调到6.56.82 2、在基础料中加入维持、在基础

48、料中加入维持pHpH的物质的物质，如，如具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等3 3、通过补料调节、通过补料调节pH pH 在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调与调pH没有矛盾时采用补料调没有矛盾时采用补料调pH如（如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH(2)当当NH2-N低，低，pH低时补氨水；低时补氨水；当当NH2-N低，低，pH高时补高时补(NH4)2SO44 4、当补料与调、当补料与调pHpH发生矛盾时，加酸碱调发生矛盾时，加酸碱调pH pH PHPH调节的方法

49、主要有下列几种：调节的方法主要有下列几种：添加碳酸钙法添加碳酸钙法氨水流加法氨水流加法尿素流加法尿素流加法(1)(1)添加碳酸钙法添加碳酸钙法 采用采用生理酸性铵盐作为氮源生理酸性铵盐作为氮源时，由时，由于于NHNH4 4+ +被菌体利用后，剩下的酸根引起发酵液被菌体利用后，剩下的酸根引起发酵液PHPH值下降，在培养基中加入碳酸钙，就能起到值下降，在培养基中加入碳酸钙，就能起到调节调节PHPH值的作用。但是，值的作用。但是，碳酸钙的用量甚碳酸钙的用量甚大，在操作上易引起染菌的危险大，在操作上易引起染菌的危险，此，此法一般不采用。法一般不采用。(2)(2)氨水流加法氨水流加法 在发酵过程中根据在

50、发酵过程中根据PHPH值的变化流加氨水调节值的变化流加氨水调节PHPH值，且值，且作为氮源作为氮源，供给，供给NHNH4 4+ +。氨水价格便氨水价格便宜，来源容易宜，来源容易。但是，但是，氨水作用快，对发酵液的氨水作用快，对发酵液的PHPH值波值波动影响大动影响大，应采用，应采用少量多次流加少量多次流加，以免造，以免造成成PHPH值过高，抑制菌体生长，或值过高，抑制菌体生长，或PHPH值过低，值过低，NHNH4 4+ +不足等现象。具体流加方法应根据菌种特性、不足等现象。具体流加方法应根据菌种特性、长菌情况、耗糖情况等决定，一般控制长菌情况、耗糖情况等决定，一般控制PHPH值值7.07.08

51、.08.0，最好能够采用自动控制连续流加方法。，最好能够采用自动控制连续流加方法。(3)(3)尿素流加法尿素流加法 是目前国内味精厂普遍采用的方法。以是目前国内味精厂普遍采用的方法。以尿素尿素作为氮源进行流加调节作为氮源进行流加调节PHPH值值，由于，由于PHPH值值变化具有一定的规律性，易于操作控制。变化具有一定的规律性，易于操作控制。首先，由于通风、搅拌和菌体尿酶作用使尿素分解首先，由于通风、搅拌和菌体尿酶作用使尿素分解放氨，使放氨，使PHPH值上升；值上升；氨和培养基成分被菌体利用并形成有机酸等中间代氨和培养基成分被菌体利用并形成有机酸等中间代谢产物，使谢产物，使PHPH值降低，这时就需

52、要及时流加尿值降低，这时就需要及时流加尿素，以调节素，以调节PHPH值和补充氮源。值和补充氮源。当流加尿素后，尿素被菌体尿酶分解放出氨使当流加尿素后，尿素被菌体尿酶分解放出氨使PHPH值上升，氨被菌体利用和形成代谢产物使值上升，氨被菌体利用和形成代谢产物使PHPH值值下降，再次进行流加反复进行维持一定的下降，再次进行流加反复进行维持一定的PHPH值。值。流加时除主要根据流加时除主要根据PHPH值得变化外，值得变化外，还应考虑到还应考虑到菌体生长、耗糖、发菌体生长、耗糖、发酵的不同阶段来采取少量多次流酵的不同阶段来采取少量多次流加加，维持维持PHPH值稍低些，以利长菌。值稍低些，以利长菌。当当长

53、菌快，耗糖快，流加量可适当多长菌快，耗糖快，流加量可适当多些，些，PHPH值可略高些，发酵后期以有利于促进值可略高些，发酵后期以有利于促进产谷氨酸，维持产谷氨酸，维持PHPH值值7.27.2左右为好。左右为好。当当残糖已很少，接近放罐残糖已很少，接近放罐，以不加或少加，以不加或少加为好，以免造成浪费和增加后工序提取的困难。为好，以免造成浪费和增加后工序提取的困难。当当pHpH值高于值高于7 75 5时，菌体易于老化，呈现球状；当时，菌体易于老化，呈现球状；当pHpH值低于值低于6 65 5时菌体时菌体同样受抑制，易于老化。而在同样受抑制，易于老化。而在7 72 2左右时，菌体是处于产酸左右时，

54、菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在期，呈现长的椭圆形；在6 69 9左右时，菌体处于生长期，呈左右时，菌体处于生长期，呈“八八”字形状并占有绝对的优势。字形状并占有绝对的优势。pH6pH69 9时，菌体生长旺盛，时，菌体生长旺盛，pH7pH71515时，对菌体的时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段阶段pHpH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9pH6.9，到，到48h48h后后pHpH值为值为7 71515，到，到80h80h后后pHpH值为值为7 72525。产率。产率222227

55、g27g/L/L，产酸率提高，产酸率提高12122323。克拉维酸发酵中克拉维酸发酵中pH变换控制变换控制问题的提出问题的提出：在在pH低时菌体生长受抑制，在低时菌体生长受抑制，在高高pH时克拉维酸要分解时克拉维酸要分解用用2.52.5升罐进行的不控制升罐进行的不控制pHpH的发酵发现，前的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使使pHpH降至降至6.56.5。在达到最高细胞浓度后，。在达到最高细胞浓度后，pHpH开始从开始从6.56.5升至升至8.38.3。CACA产量达最高水平时，产量达最高水平时，pHpH不再升高。在发酵终止时，不再升高。在发

56、酵终止时，pHpH再次升至再次升至8.58.5。随着。随着pHpH升高，升高，CACA迅速分解。迅速分解。研究不同研究不同pH对发酵的影响对发酵的影响分别配置分别配置pH为为6.0，7.0，8.0的培养基测的培养基测定菌的生长和产物合成定菌的生长和产物合成pH6.0时，生长受时，生长受抑制，产物降解抑制，产物降解少少pH8.0时生长良好时生长良好产量低，产物降解产量低，产物降解pH7.0时的状况时的状况控制控制pH7.0pH7.0和和8.08.0时，最高细胞浓度接近相同时，最高细胞浓度接近相同( (约约1616PMV)PMV)，但控制，但控制pH6pH60 0时细胞生长受抑制。时细胞生长受抑制

57、。在在2 25 5升生物反应器内，升生物反应器内，不控制不控制pHpH时时2 247g47g(m1(m1h )h )控制控制pH7.0pH7.0时的产率时的产率3 337g37g(m1(m1h) h) 最高最高控制控制pH8.0pH8.0时，产率时，产率2 202g02g(m1(m1h) h) 在控制在控制pH6pH60 0时，时，CACA产生被抑制产生被抑制, ,但降解少但降解少因此对细胞生长和因此对细胞生长和CACA产生最好将产生最好将pHpH控制于控制于7.07.0，但在控制但在控制pH7.0pH7.0时，仍出现时，仍出现CACA的迅速分解。的迅速分解。由于由于CACA生产的最适生产的最

58、适pHpH和减少和减少CACA分解的分解的pHpH各不相各不相同，因此在同，因此在，使发酵，使发酵pHpH由中性由中性pH7pH70 0变换为酸性变换为酸性pH6.0pH6.0。在发酵前期，在细胞生长和产生在发酵前期，在细胞生长和产生CACA期间控制期间控制pH7.0pH7.0，4d4d后，当后，当CACA产量达最高值时，变换产量达最高值时，变换pHpH为为6.06.0，以减少，以减少CACA分解。最高分解。最高CACA浓度可保持浓度可保持24h24h。由于改变由于改变pHpH，使，使CACA分解速率明显降低。分解速率明显降低。pHpH控制是一项非常细致的工作，控制是一项非常细致的工作，不仅考

59、虑最佳不仅考虑最佳pHpH值，而且值，而且要根据要根据生长阶段考察对生长阶段考察对pHpH的要求的要求。在。在pHpH控制中还要采用合适的调节方法。控制中还要采用合适的调节方法。总结总结小小 结结发酵过程发酵过程pH会发生变化会发生变化变化原因变化原因基质代谢基质代谢产物形成产物形成菌体自溶菌体自溶对发酵的影响对发酵的影响pHpH影响酶的活性影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的值影响微生物细胞膜所带电荷的改变改变pH值影响培养基某些成分和中间代值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离谢物的解离pH影响代谢方向影响代谢方向 pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响在微生物培养的不同阶段有不同

60、的影响 pHpH的的控控制制方方式式基础培养基调节基础培养基调节pH在基础料中加入维持在基础料中加入维持pH的的物质物质通过补料调节通过补料调节pH 当补料与调当补料与调pH发生矛盾时，发生矛盾时，加酸碱调加酸碱调pH 发酵的不同阶段采取不同的发酵的不同阶段采取不同的pH值值选择合适的选择合适的pH调节剂调节剂从图中可见，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶从图中可见，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两个阶段：前个阶段：前10 h是菌体生长期，之后热凝胶是菌体生长期，之后热凝胶开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。开始合成，至发酵结束是热