基因引物设计ppt课件

1、常用实验技术简介黄雪娜2019-8-4目目 录录n全长cDNA克隆n引物设计n染色体步移技术全长全长cDNA克隆克隆n是许多后续更深化实验的根底；n真核生物mRNA的特征及转录过程的了解；n全长cDNA克隆方法：灵敏掌握；n同源克隆技术nRACE-PCR技术基因克隆前的预备任务基因克隆前的预备任务n看有没有被他人克隆出来；n查看文献了解基因的功能及表达特征；n了解该基因能够涉及的任务如激酶活性的测定及DNA-蛋白相互作用等，制定方案；n了解相近物种该基因的信息，以利于扩增过程中预测PCR的延伸时间；同源片段的克隆同源片段的克隆n本实验室的EST数据库；nNCBI数据库；nRT-PCR用兼并引物

2、扩增同源片段；n设计兼并引物是重点！本卷须知：本卷须知：n高质量的mRNA和高效率的逆转录；n加大引物浓度；n选择mRNA表达量高的组织做模板；n梯度PCR或者降落PCR；n巢氏PCR;n序列分析；3RACE:n原理：5RACEn原理：本卷须知：本卷须知：nRNA的完好性；的完好性；n高效的逆转录酶；高效的逆转录酶；n多次多次5RACE相结合；相结合；n运用丰度高的组织做模板；运用丰度高的组织做模板；n长片段扩增运用长片段扩增运用LA-Taq酶；酶；n同源克隆方法；同源克隆方法；n用随机引物或者用随机引物或者OligoT引导逆转录；引导逆转录；序列分析序列分析n引物设计：Primer 5.0；

3、n普通的序列处置：DNAStar中的Editseq；n序列拼接： DNAStar中的Seqman、BL2；n序列在线比对：NCBI-BLAST ( / )；n序列多重比对：Bioedit、ClustalW2 (ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)；n寻觅ORF: Editseq、ORF Finder ( /gorf/gorf.html )；n序列作图：Bioedit、EMBOSS ( emboss.bioinformatics.nl/ )；n构建进化树:MEGA 4.1；n蛋白构造域分析：SM

4、ART( smart.embl-heidelberg.de/ )；n蛋白理化性质分析及二、三级构造分析：EXPASY( expasy.ch/tools/ )、Psipred ( bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ )；n信号肽分析：SignalP( cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )；n磷酸化位点分析：NetPhos 2.0 Server ( cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )；n糖基化位点：NetNGlyc 1.0 Server ( cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ )；引物设计引物设计n兼并

5、引物nRACE引物n荧光定量引物n染色体步移引物n原核表达用引物nPCR-SSCP引物总原那么总原那么n 引物运用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 n 产物不能构成二级构造。 n 引物长度普通在1530碱基之间。n G+C含量在40%60%之间。 n 碱基要随机分布。 n 引物本身不能有延续4个碱基的互补。n 引物之间不能有延续4个碱基的互补。n 引物5端可以修饰。 n 引物3端不可修饰。 n 引物3端要避开密码子的第3位。 兼并引物兼并引物n兼并碱基：n M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/G/T D=A/G/T n B=G/C/

6、T N=A/G/C/T n简并度：兼并引物设计步骤兼并引物设计步骤n利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 n对所找到的序列进展多序列比对n确定适宜的保守区域n设计兼并引物软件或者人工n选择适宜的序列进展多重比对；n选择高度保守的序列作为引物；n人工设计时要留意引物序列是和原序列一样还是反向互补的；n简并度不能太高，可用次黄嘌呤替代N；n引物的3端残基尽能够运用确定残基 ；n降落PCR;n巢氏PCR;RACE引物引物n各3条重叠的引物，引物之间最好间隔100-200bp；n假设同源片段长度太短，可先做3RACE，再做5RACE；n尽量接近cDNA末端3RACE-3末端； 5RACE-5末端；荧光定量引物荧光定量引物n纯化方式：PAGE；n产物长度：80-150bp；nTM值:58-62;n在编码区内接近3末端处设计；n高的特异性：测序及熔解曲线分析；染色体步移引物染色体步移引物n以DNA为模板设计引物；n3条重叠引物；n高的退火温度：高于60度；原核表达用引物原核表达用引物n会读表达载体图谱；n去除信号肽序列；n根据目的表达序列直接取相应序列作为引物，留意要不要加终止密码子；n在引物的5末端加酶切位点和相应的维护碱基，留意方向；n选酶切位点：选择常用的内切酶，并看这两种酶能否