脑缺血病人血小板肌球蛋白轻链激酶和Ca2+、Mg2+-ATP酶活性及其与Ca2+i关系的研究

1、    脑缺血病人血小板肌球蛋白轻链激酶和Ca2+、Mg2+-ATP酶活性及其与Ca2+i关系的研究        摘要目的探讨急性缺血性脑血管病血小板肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的变化及与血小板胞浆游离钙浓度Ca2+i的关系。方法用32P同位素掺入法和比色法分别测定58例脑缺血病人，及35名健康对照者血小板MLCK和Ca2+、Mg2+-ATP酶活性。用荧光钙指示剂Fura-2负载血小板扫描的方法，测定脑缺血病人血小板Ca2+i浓度。结果TI

2、A组和脑梗死组MLCK活性与对照组相比均有明显增加(P<0.01)，而Ca2+、Mg2+-ATP酶活性均低于对照组(P<0.05,P<0.01)。TIA组和脑梗死组血小板静息Ca2+i；均高于对照组；血小板静息Ca2+i与血小板MLCK活性呈显著正相关(P<0.01)，而与血小板Ca2+、Mg2+-ATP酶活性呈负相关(P<0.05)。结论血小板MLCK和Ca2+、Mg2+-ATP酶活性与急性缺血性脑血管病的发生有密切关系，MLCK活性的变化可能是脑缺血病人血小板活化的分子基础。关键词血小板钙离子Ca2+、Mg2+-ATP酶肌球蛋白轻链激酶脑缺血 在急性缺血性脑血

3、管病的发病过程中，血小板功能亢进是一极其重要的因素1。血小板细胞内Ca2+i的变化，在介导血小板对各种外部刺激的反应过程中起着重要作用，而血小板膜上的钙泵，即Ca2+、Mg2+-ATP酶是调节胞内Ca2+i的关键因素。血小板活化的分子基础是胞内骨架蛋白的变化，其中肌球蛋白轻链激酶(MLCK)磷酸化肌球蛋白轻链，促使肌球蛋白与肌动蛋白结合在血小板活化过程中起重要作用2。由于该酶活性不稳定，且测定需同位素，较为复杂，故至今尚未见有关血小板MLCK测定的国内文献报道。本研究通过测定急性缺血性脑血管病患者血小板静息态Ca2+i、MLCK和Ca2+、Mg2+-ATP酶活性，以探讨它们与脑缺血的关系以及C

4、a2+i与这两种酶活性的相关性。1资料与方法1.1急性缺血性脑血管病患者58例，诊断均符合全国脑血管病制定的诊断标准，并全部经头颅CT或MR证实。其中男性39例，女性19例。平均年龄57.8±10.3岁。58例中，有23例为短暂性脑缺血发作TIA患者，其余35例为脑梗死患者。正常对照组35例，为正常体检者及志愿献血者。其中男性22例，女性13例。平均年龄52.6±12.2岁。1.2方法病人入院后48h内，清晨空腹取静脉血810ml，缓慢注入含3.28%枸橼酸钠的塑料试管中，混匀抗凝，按常规方法，立即分离血小板。1.2.1血小板MLCK的制备按文献3的方法。1.2.2血小板M

5、LCK活性测定基本按Harada等4的方法，但略有改动。反应总体积为50l。含有0.2g/LLC20，50mg/LMLCK，50mmol/L ATP(300cpm/pmol ATP)等。1.2.3血小板膜Ca2+、Mg2+-ATP酶测定血小板膜制备按Dean5法但略有简化。Ca2+、Mg2+-ATP酶活性测定按改良Gulati6法进行。1.2.4血小板Ca2+i测定采用荧光指示剂Fura-2Am法7，用岛津荧光光度计测定血小板静息态Ca2+i，按如下公式计算：Ca2+i(nmol/L)=224×(F-Fmin)/(Fmax-F)蛋白质浓度的测定按Bradford法，以牛血清蛋白为标准

6、。统计学处理用成组设计的t检验和直线相关分析，数据以平均数加减标准差表示(±s)。2结果2.1对照组和脑缺血组血小板MLCK活性的比较TIA组和脑梗死组患者MLCK活性(90.36±28.60和102.25±27.62)与对照组(64.68±22.48)比较显著性升高(P<0.01)，但TIA组和脑梗死组之间MLCK活性无明显差异(P>0.05)。2.2对照组和脑缺血组血小板Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的比较TIA组和脑梗死组患者Ca2+、Mg2+-ATP酶活性(1.20±0.28和1.16±0.26)比对照组(1.3

7、8±0.33)降低(P<0.05，P<0.01)，但TIA组和脑梗死组之间该酶活性无明显差异(P>0.05)。2.3对照组和脑缺血组血小板静息态Ca2+i的比较TIA组和脑梗死组患者血小板静息态Ca2+i(147.05±42.26和179.95±46.02)均比对照组(99.78±28.04)显著升高(P<0.01)，脑梗死组Ca2+i比TIA组Ca2+i也升高(P<0.05)。2.4血小板静息态Ca2+i与MLCK和Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的相关分析健康对照组血小板静息态Ca2+i与MLCK活性呈正相关(r=0.5

8、8，P<0.01)，与Ca2+、Mg2+-ATP酶活性呈负相关(r=-0.38,P<0.05)，TIA组和脑梗死组血小板静息态Ca2+i与MLCK活性均呈正相关(r分别为0.67和0.61， P<0.01)，与Ca2+、Mg2+-ATP酶活性均呈负相关(r分别为-0.41和-0.58， P<0.05和0.01)。3讨论近年来研究认为，血小板与缺血性脑血管病有密切关系。在急性脑梗死病人，出现血小板粘附和聚集性增高，释放反应和代谢产物增多，更迭率增加等血小板功能亢进表现1。Harrison报道8使用抗血小板药物可明显减少脑缺血的发病率，降低缺血病人的死亡率。血小板的功能受多

9、种因素的影响，其中血小板胞浆内的钙离子，作为一种第二信使，在介导血小板对各种外部刺激的反应过程中起着极为重要的作用。为了维持血小板的正常功能，血小板内有一系列机制稳定细胞内Ca2+浓度，而存在于血小板内膜和浆膜上的Ca2+、Mg2+-ATPase在调节Ca2+平衡方面是非常重要的9。肌动蛋白和肌球蛋白是血小板胞浆中主要的收缩蛋白，在细胞活化过程中起重要作用。其中肌球蛋白头部分子量为2万的轻链(LC20)磷酸化是血小板活化的关键步骤。血小板胞浆中Ca2+浓度增高，与CaM结合成Ca2+-CaM复合物，激活肌球蛋白轻链，使LC20磷酸化，从而引起血小板的活化并产生收缩反应10。因此，在正常状态下，

10、Ca2+、Mg2+-ATP酶和MLCK等几种蛋白激酶协同作用，可调节血小板的变形和收缩能力，维持血小板正常的形态和功能。而在脑缺血时，血小板Ca2+持续升高，形态和功能都有变化，包括血小板粘附、聚集增加，释放反应增多，其原因很可能与Ca2+、Mg2+-ATP酶和MLCK活性异常有关。本实验结果表明，在急性缺血性脑血管病人的血小板，MLCK活性明显增加，并且其活性的增高与胞浆Ca2+i的增加呈正相关，其原因很可能是由于胞浆中Ca2+浓度增高，通过钙调素的调节作用，使MLCK异常活化，而胞浆中Ca2+浓度的增加与Ca2+泵的活性下降有直接的关系。本实验的结果亦证明了Ca2+、Mg2+-ATP酶活性

11、的降低。总之，本研究提示，急性缺血性脑血管病患者血小板Ca2+代谢异常可能是血小板活化的分子基础。由于Ca2+、Mg2+-ATP酶的活性降低，导致胞内Ca2+浓度的增加，从而使MLCK异常活化，引起血小板一系列形态和功能的变化，加重脑缺血的发生。由于MLCK活性在脑缺血时变化较为明显，且能直接反映血小板的功能状态，因此我们认为MLCK活性的测定对判断血小板的功能状态，指导临床诊断治疗缺血性脑血管病都具有重要的意义。基金项目：本文为江苏省卫生厅科研基金课题作者单位：唐放鸣王然张光毅221002徐州医学院生物化学和分子生物学研究中心；耿德勤附属医院神经内科参考文献1 Joseph R,Andrea

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