免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定酱油醋中黄曲霉毒素B_1

1、仪器与应用免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定酱油醋中黄曲霉毒素B1王晶1张鹏2张艺兵2王雄3(国家标准物质研究中心北京1000131(青岛出入境检验检疫局2660022(北京中检维康技术有限公司1000443E2mail:jing wang20318摘要试样经过甲醇2水提取,提取液经过滤、水稀释、用键合有黄曲霉毒素B1特殊抗体的免疫亲和柱净化,通过高效液相色谱仪测定黄曲霉毒素B1。免疫亲和层析净化高效液相色谱柱后衍生法,测定酱油和醋中黄曲霉毒素B1的检出限为1g/kg;添加回收率在80%上。该方法准确、简单、快速、安全。关键词免疫亲和层析;高效液相色谱;黄曲霉毒素B1;酱油;醋中图分类号R15

2、Determination of A flatoxin B1in Soy and Vinegar by ImmunoaffinityColumn and H igh Performance Liquid ChromatographyWang Jing1,Zhang Peng2,Zhang Y ibing2,Wang X iong3(National Research Center for Certified Reference M aterials,Beijing,100013,China1(QingDao Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau

3、,Qingdao,266002,China2(Beijing Clover T echnology Ltd.,Beijing,100044,China3AbstractA fter being extracted with CH3OH2H2O,the sam ple extract was filtered,diluted with water and applied to affinity column containing m onoclonal specific antibody for aflatoxin B1.A flatoxin B1in soy and vinegar were

4、quanti2 tated by HP LC with fluorescence detection and postcolumn.The detection lim its of A flatoxin B1reached1g/kg.The rates of recovery were m ore than80%by this method.This method was accurate,sim ple,rapid and safet.K ey w ordsimmunoaffinity column;HP LC;aflatoxin B1;soy;vinegar黄曲霉毒素是从所周知的最危险的毒

5、素之一,黄曲霉毒素是曲霉菌及曲霉寄生菌族类产生的一类结构相似的有毒化合物。在合适的温度、湿度条件下,这类真菌会在各种食品或粮谷类作物中生长,并产生毒素。1993年,黄曲霉毒素被世界卫生组织(WH O的癌症研究机构划定为I类致癌物。由于黄曲霉毒素与环境因素密切相关,是一种天然的毒素,普通的食物处理方法不会减少黄曲霉毒素的含量,因此国际上对黄曲霉毒素的限量要求也日益严格。国家质量监督检验检疫总局、国家卫生部从2000年加大力度监督抽查大米、小麦、植物油、酱油、食醋等五大类粮油食品,其中黄曲霉毒素B1是一项重要的指标。我国规定发酵食品(酱油、食用醋黄曲霉毒素B1限量小于等于5g/kg。控制这类由真菌

6、污染而形成的真菌毒素的最佳方法是防止食品受污染或食入已污染的食品,快速、有效的检验方法是检测食品中是否受黄曲霉毒素污染的最有效手段。通过检验食品中的黄曲霉毒素含量,以保证生产的食品安全、无毒。目前我国传统黄曲霉毒素分析一般采用薄层色谱(T LC法、高效液相色谱(HP LC法1,2。T LC虽然简便,但灵敏度差;HP LC虽然灵敏度高,但样品前处理烦琐,操作复杂,时间长。特别对我国特有的酱油和醋调味品,传统方法不是很适用。免疫亲和柱(Immunoaffinity C olumn,I AC的使用不仅比T LC法和酶联免疫吸附法准确,还可以避免传统T LC和HP LC的缺点,同时免疫亲和柱与T LC

7、和HP LC法结合可以大大提高工作效率,提高灵敏度和收稿日期:2002-07-28作者简介:王晶,1968年生,高级工程师,博士,毕业于中国农业大学,一直从事食品安全技术研究工作。55现代科学仪器20032准确度,达到既定量准确又快速简便的要求3,4。免疫亲和层析净化与T LC和HP LC法用在测定酱油和醋中却不多见,还没有报道免疫亲和层析净化高效液相色谱法对酱油和醋中黄曲霉毒素的测定。根据国内需求,本文主要介绍免疫亲和层析净化高效液相色谱法(I AC/HP LC法测定酱油和醋中黄曲霉毒素B1。1理论部分试样经过甲醇水提取,提取液经过过滤、稀释后,滤液经过交联在免疫亲和层析介子上有黄曲霉毒素特

8、殊抗体的免疫亲和柱净化,此抗体对黄曲霉毒素B1具有专一识别能力,黄曲霉毒素键合在分离柱中的抗体上。用蒸馏水将免疫亲和柱上杂质除去,以甲醇通过分离柱洗脱,于HP LC柱后衍生化后测定试样甲醇洗脱液黄曲霉毒素B1。2实验部分2.1试剂除特殊说明外,试剂为分析纯,水为重蒸馏水。甲醇:色谱纯乙腈:色谱纯苯2乙腈(98+2氯化钠(NaClpH7磷酸盐缓冲溶液0.1%吐温/P BS溶液黄曲霉毒素B1:纯度99%(美国sigma公司黄曲霉毒素标准贮备溶液:用苯2乙腈(98+2溶液配制0.100mg/m L的黄曲霉毒素B1标准贮备液,保存于4备用。黄曲霉毒素标准工作液:根据需要准确移取适量的黄曲霉毒素B1标准

9、贮备液,用苯2乙腈(98+2溶液稀释成标准工作液。柱后衍生溶液(0.05%碘溶液:称取0.1g碘溶液,溶解于20m L甲醇后,加水定容至200m L,以0. 45m的尼龙滤膜过滤,4避光保存。2.2主要仪器高速均质器(美国Vicam公司玻璃纤维滤纸直径11cm,孔径1.5m(美国Vicam 公司免疫亲和柱(美国Vicam公司:内含单株抗体对黄曲霉毒素B1具有专一性。空气压力泵(美国Vicam公司玻璃试管(12mm×75mm,无荧光特性玻璃注射器HP1100型高效液相色谱(具有365nm激发波长和大于420nm发射波长的荧光检测器微量注射器C18色谱柱2.3样品提取方法2.3.1酱油称

10、取试样25.0g于250m L具塞锥形瓶中,加入2.5g氯化钠及100m L甲醇2水(8+2,以均质器高速搅拌提取1min。定量滤纸过滤,准确移取10.0m L滤液并加入40.0m L水稀释,用玻璃纤维滤纸过滤1次,至滤液澄清,备用。2.3.2食醋称取5.0g样品,加入1.0g氯化钠,以pH7磷酸盐缓冲溶液稀释至25m L,混匀,过滤。取10m L滤液加入10m L缓冲液,混匀。以玻璃纤维滤纸过滤1次,至滤液澄清,备用。2.4净化方法将免疫亲和柱连接于20m L玻璃注射器下。准确 移取10m L样品滤液过免疫亲和柱,用10m L0.1%的吐温/P BS清洗。再以10m L水清洗柱子2次,弃去全

11、部流出液,并使23m L空气通过柱体。准确加入1.0m L液相色谱级甲醇洗脱,流速为12m L/min,收集洗脱液于玻璃试管中,供检测用。2.5测定方法于高效液相色谱仪测定样品甲醇洗脱液中黄曲霉毒素B1。2.5.1测定条件C18色谱柱:150×4.6mm,5m。流动相:甲醇:水(45:55,用前脱气。流动相流速:0.8ml/mim。荧光检测器:激发波长365nm,发射波长440nm。柱后衍生化系统:衍生溶液:0.05%碘溶液,衍生溶液流速:0.2m L/mim,反应温度:70,反应时间:1min。2.5.2样液测定取黄曲霉毒素混合标准液100L注入HP LC系统中,得到标准色谱图(图

12、1。图1黄曲霉毒素B1标准谱图取样品洗脱液1m L加入超纯净水定容至2m L,取100L注入HP LC系统中,得到样品色谱图。经过与标准液谱图比较得到黄曲霉毒素B1浓度。65M odern Scientific Instruments200323结果与讨论3.1方法线性关系和检出限在此色谱条件下,免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1的系列标准溶液的线性方程相关系数达到0.999以上,黄曲霉毒素B1的保留时间为6.7(图1。在上述分析条件下,免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定酱油和醋中的黄曲霉毒素B1的检出限为1g/kg。此测定方法的检出限达到我国黄曲霉毒素B1限量检测要求,而且远低

13、于我国黄曲霉毒素B1限量标准要求。3.2准确度和精密度实验表1免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定酱油和醋中黄曲霉毒素B1的回收率和精密度样品添加浓度(g/kg实侧值(g/kg回收率(% 变异系数CV(%酱油1.00.8888.48.422.0 1.8090.13.72 5.04.2585.0 4.40醋1.00.8282.4 3.772.0 1.6683.04.015.0 4.2284.8 3.26分别对酱油和醋进行3个水平浓度添加回收率试验,重复操作7次,回收率试验平均值和变异系数结果见表1。免疫亲和层析净化高效液相色谱法回收率在80%以上,对酱油的添加回收率在85.0%90. 1%,变异系

14、数为3.72%8.42%,对醋的添加回收率在82.4%84.8%,变异系数为3.26%3.77%。图2为酱油和醋中黄曲霉毒素B1添加浓度为1g/kg的色谱图。图2酱油和醋中黄曲霉毒素B1谱图参考文献1中华人民共和国国家标准G B/T5009.2321996.食品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的测定方法.1111132中华人民共和国国家标准G B/T5009.2221996.食品中黄曲霉毒素B1的测定方法,1021073M ary W.T rucksess,M ichael E.S tack,S tanley Nesheim,Samuel W.Page etal.Immunoa2ffinit

15、y C olumn C oupled with S olution Fluorometry or Liquid Chromatography P ostcolumn Derivatization for Determination of A flatoxins in C orn.Peanuts.and Peanut Butter:C ollaborative S tudy.J.ASS OC.OFF.ANA L.CHE M.1991.74(1:81884AOAC O fficial M ethod991.31.A flatoxins in C orn,Raw Peanuts,andPeanut

16、Butter.AOAC official M ethods of Analysis.Supplement M arch 1995.2021关于举办“第九届国际电分析化学研讨会”的通知“第九届国际电分析化学研讨会”经中国科学院批准,并受中国化学会委托,由中国科学院长春应化所电分析化学国家重点实验室举办。研讨会将于2003年10月10日至12日在长春应化所举办。研讨会将特邀40多名国际著名电分析化学家参加,会议主要语言为英语。欲参加研讨会的同志(如提出报告,请交英文摘要一份,格式要求见网页http:w w 0431-*,电子邮件:blzhang联系,随后寄上第二轮通知(注册费480元。国际顾问委员会M.Aizawa(日,F.C.Ans on(美,A.J.Bard(美,G.Bidan (法,A.M.Bond(澳,G.Christian(美,S.C onsnier(法,A. Deronzier(法,S.D ong(中,主席M.Fujihira(日,H.G irault(瑞士,Lo G orton(瑞典,R.G uilard(法,W.R.Hein