加氧低温灌流下31磷-磁共振频谱与肝酶测定在判断大鼠供肝活力中的意义

1、    加氧低温灌流下31磷-磁共振频谱与肝酶测定 在判断大鼠供肝活力中的意义        【摘要】目的探讨判断经受热缺血的肝脏活力的方法。方法将18只SD大鼠随机分成3组：A组肝脏热缺血时间（WI）为0min；B组WI为30min；C组WI为60min。各组肝脏冷保存后22.5h，采用31磷-磁共振频谱（31P-MRS）测定各组加氧低温灌流30min时的离体肝脏频谱，同时测定保存液和灌流液中肝酶的变化。结果-三磷酸核酸（-NTP）与亚甲基二磷酸（MDP）的比值，

2、B组与A组比较， P>0.05；C组与A、B组比较，P<0.01。肝酶测定结果：随着热缺血时间的延长，保存液中的肝酶逐渐升高，每组之间比较，差异均有显著性(P<0.05)；灌流液中的肝酶，A组与B组比较，差异无显著性(P>0.05)，C组与A、B两组比较，差异均有极显著性（P<0.01）。结论测定加氧低温灌流下大鼠离体肝脏的ATP再生能力能较好判断其活力，该方法在临床热缺血供肝活力的判断上具有一定参考价值；同时测定保存液和灌流液中的肝酶含量，能配合31P-MRS判断肝脏的活力。【关键词】肝脏；核磁共振；酶类；创伤与损伤 Assessment of the viab

3、ility of the rat liver after warm ischemic injury via 31P-MRS of the rat liver or determination of hepatic enzymes during oxygenated hypothermic reperfusionCAI Shouwang?, GU Wanqing, FENG Yuquan（Department of Hepatobiliary Surgery of PLA, Beijing, 100853 China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the a

4、ssessment of the viability of the donor liver after warm ischemic injury. Methods18 SD rats were randomly and equally divided into 3 groups: A, B, C. Six rat livers were subjected to the warm ischemia 0, 30 and 60 min in groups A, B and C respectively. Before reperfusion all isolated livers were sto

5、red in modified Krebs-Hensleit (mK-H) solution at 0 to 4 for 2 to 2.5h. Subsequently, the livers were perfused through portal vein with oxygenated cold mK-H solution for 30 to 40 min in a 31P-MRS machine while the 31P-MRS spectroscopies were carried out. The changes in liver enzymes in stored soluti

6、on and perfused fluid were determined. ResultsThe ability of ATP regeneration of rat livers in the group B was similar to group A (P>0.05). However, in the group C, 3 of 6 rat livers could not resuscitate this ability, and the average level of ATP regeneration of group C was 32.6% of the group A,

7、 which was significantly less than that in the group A and group B（P<0.01）. With the warm ischemia prolonged，the hepatic enzymes including ALT, AST and LDH were increased gradually in stored solution with the difference being significant among the three groups (P<0.01). There was significant d

8、ifference in hepatic enzymes between group C and group A or group B (P<0.01). ConclusionsMeasurement of ability of ATP regeneration of isolated rat liver after warm ischemia could be used to assess the viability of the warm ischemic livers in clinical practice. Determination of the levels of hepa

9、tic enzymes in the stored solution and the perfused solution could evaluate the hepatic viability cooperating with 31P-MRS. 【Key words】Liver；Nuclear magnetic resonance；Enzymes；Wounds and injuries由于供肝常受到热缺血损伤，因此，迫切需要建立一套精确判断供肝活力的方法。检测供肝活力的方法很多，如肝活检、肝功能生化检查、动脉酮体比、利多卡因试验、供肝三磷酸腺苷（ATP）含量测定等，由于受到不同客观因素的影响

10、，上述方法的实用价值存在争议1。一般认为肝移植后的ATP再生能力与移植物的早期存活存在相关性2，3。我们采用31磷-磁共振频谱（31P-MRS）测定离体肝脏ATP再生能力，并测定保存液和灌洗液中的肝酶含量，以探讨其在判断经受热缺血的肝脏活力中的意义。材料与方法一、材料SD大鼠18只（解放军总医院实验动物中心提供），雌雄不限，体重170220g。将大鼠随机分成3组，每组6只：A组热缺血时间（WI）0min；B组WI为30min；C组WI为60min。保存液和灌流液均采用改良的Krebs-Hensleit液（K-H液，解放军总医院制剂室配制），配方为：NaCl 118mmol/L，KCl 4.70

11、mmol/L，CaCl2 2.25mmol/L，MgSO4 1.18mmol/L，KH2PO4 0.118mmol/L，NaHCO3 24.9mmol/L，葡萄糖11.1mmol/L。采用核磁共振仪测定频谱。二、实验方法实验大鼠以质量分数为20%乌拉坦腹腔注射麻醉（1 400mg/kg）。从肾静脉开口下方的腔静脉注入含肝素100U/ml的乳酸林格液2ml作全身肝素化，结扎脾静脉，从肠系膜上静脉插入18G导管针至门静脉，予双重结扎、固定，同时迅速结扎肝动脉。A组大鼠在完成肝门阻断后迅速剪断肝下下腔静脉，并从门静脉注入04乳酸林格液50ml灌洗肝脏，迅速剪断肝上下腔静脉、肠系膜上静脉、脾静脉和肝动

12、脉。将离体肝脏浸泡在04改良K-H液60ml中冷保存22.5h。B组和C组大鼠在阻断肝血流后分别按分组要求临时关腹30和60min，使肝脏承受热缺血30和60min，其余步骤与A组相同。将待灌流的离体肝脏放入外径为25mm的测试管中，使其悬浮并固定在装有04改良K-H液的测试管的下段。与肝脏平行的位置贴管壁放一含10mol/L亚甲基二磷酸（MDP）外标毛细管，线圈的温度控制在（9±1）。保持灌流液液面距肝脏的高度为20cm。实验过程中持续向灌流液内灌以含95%O2和5%CO2的混合气体（1L/min），氧饱合后的灌流液pH为7.35(8)。灌流液流入肝脏时的温度控制在（8±

13、0.5），灌流速度为（12±2）ml/min。测定每个肝脏持续灌流30min的频谱。核磁共振（NMR）频谱测定条件：采用日本JEOL GX-400 NMR频谱仪，立式窄孔（孔径54mm）磁体，磁场强度9.4T（特斯拉）。25mm标准磷探头，共振频率为161.83MHz。采用4k数据点，谱宽设10kHz。不锁场，调匀场至水的质子（1H）信号半峰宽达70100Hz。单脉冲序列非去偶方式测定，脉冲倾角45°，脉冲宽度55s，采样时间0.41s，脉冲间隔0.5s，每个谱为扫描256次所得的信号累加。傅立叶变换前加指数窗函数，采用40Hz线的增宽因子以提高信噪比。取每只大鼠肝脏的保存

14、液标本1ml及灌流液（前30min）1ml，放入-40 冰箱保存、集中，采用日立7150全自动生化分析仪测定保存液、灌流液内的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）及乳酸脱氢酶（LDH）含量。三、统计学处理所得数据以均数±标准差表示，采用方差分析检验。结果一、含氧改良K-H液灌流A、B、C三组大鼠肝脏的频谱结果1为A组1只大鼠肝脏冷保存2.5h后灌流30min所得的频谱，典型31P-MRS含有6个谱峰：磷酸单酯（PME）、磷酸二酯（PDE）、无机磷酸盐（Pi）和3个三磷酸核苷（、-NTP）。由于-三磷酸核酸（-NTP）信号几乎完全来自于ATP，因此常将其作为ATP的一个内在

15、量化标准3。0min时各组均测不到-NTP信号，随着灌流的开始，-NTP出现并逐渐上升。表1为各组各个时间点-NTP与外标MDP的比值，A组灌流各个时间点-NTP峰值均高于B组、C组。灌流30min时，A组-NTP/MDP较B组高8.5%，但差异无显著性（P>0.05）。灌流10min和20min，A、B两组-NTP/MDP相比，差异亦无显著性（P>0.05）。C组有3个肝脏的-NTP不能检出，另3个虽能检出，但峰值亦明显偏低（灌流30min时-NTP/MDP约为A组的65.2%）。灌流10、20、30min等各个时间点的-NTP/MDP值，A、B两组均明显高于C组，差异有极显著性

16、（P<0.01）。     表13个组灌流各时间点-NTP与MDP的比值组别n灌流不同时间点的-NTP/MDP值0min10min20min30minA组600.285±0.0340.352±0.0790.423±0.059B组600.275±0.0330.338±0.0600.387±0.065C组600.102±0.1130.127±0.1450.138±0.156     二、保存液及灌流液中肝酶的测定结果保存液及

17、灌流液中ALT、AST及LDH的含量见表2。3种肝酶中以LDH升高最为明显，C组灌流液中的LDH分别为A、B二组的85倍和37倍；C组可以测到-NTP信号的灌流液（3只）中的LDH平均值为168.3×10-2mol.s-1.L-1，测不到-NTP信号的另3只灌流液中的LDH平均值为398.5mol.s-1.L-1，为前者的2.4倍。 表2保存液与灌流液中的肝酶含量（mol.s-1.L-1）组别nALTASTLDH保存液灌流液保存液灌流液保存液灌流液A组 63.2±1.5*3.8±1.26.8±3.2*7.2±3.318.7±5.3*3

18、.3±2.8B组622.2±9.2*7.0±3.8*46.4±15.4*9.7±6.0*154.0±103.2.7.7±3.2*C组650.8±40.2*44.6±28.680.2±31.7*45.1±8.0440.7±228.6*283.4±169.0     注：.各组间比较，P<0.05；.与A组比较，P>0.05；与A、B组比较，P<0.01 讨论器官离体后氧和各种代谢底物终止供应，氧化磷酸化作用减弱

19、，ATP二磷酸腺苷（ADP）一磷酸腺苷（AMP）次黄嘌呤黄嘌呤尿酸依次降解，ATP的含量迅速降低，37 时肝脏缺血5min，或者冷保存130min，31P-MRS即不能检测到-NTP4。当血液和能量代谢底物供应恢复时，即使在低温情况下，有活力的器官能很快利用AMP、嘌呤合成ATP5。因此，许多学者认为动态观察ATP再生能力是判断器官活力的最有效的指标2，6，7。我们观察到，冷保存后2h，即难以测到-NTP，说明灌流前不可能通过测定-NTP绝对水平来判断供肝的活力。灌流开始后，A、B两组灌流10min时即能测到-NTP，而且两组各个时间点的-NTP/MDP相比，差异均无显著性，说明其承受的30m

20、in热缺血损伤是可逆的，而C组有3个肝脏灌流后仍测不到-NTP信号，说明其已丧失活力，另3个的-NTP峰值亦明显偏低，与A组比较，这3个肝脏的活力亦明显受损。肝脏承受冷、热缺血到一定程度时，肝细胞胞浆会出现空泡变，空泡变胞浆膜破裂释放各种肝酶，引起肝细胞不可逆损伤5,8。因此，肝酶，特别是LDH能较好地反映肝脏受损程度及活力9。我们的实验观察到，随着热缺血时间的延长，肝脏保存液和灌流液中的肝酶依次升高（表2），其中以LDH升幅最为明显。同时，我们还发现，与保存液不同，灌流液中的肝酶，A、B两组之间的差异无显著性，且明显低于C组（P<0.01），这一结果与31P-MRS所测得各组ATP再生

21、能力的结果是一致的，说明灌流液中肝酶的含量较之保存液能更好地反映肝脏的活力。加氧低温灌流与常温下的再灌注不同，一般不会出现氧诱导的组织损伤4，5，8，但这方面的问题仍有待进一步研究。作者单位：蔡守旺（100853北京，解放军总医院肝胆外科）顾万清（100853北京，解放军总医院肝胆外科）冯玉泉（100853北京，解放军总医院肝胆外科）刘永雄（100853北京，解放军总医院肝胆外科）田建广（军事医学科学院国家生物医学分析中心）陈金明（内蒙赤峰市医院）参考文献1，Jan Pruim，Ids JK，Elizabeth BH，et al. Selection criteria for liver do

22、nation: a review. Transplant Int，1993，6:226-235.2，Kamiike W, Burdelski M, Steinhoff G, et al. Adenine nucleotide metabolism and its relation to organ viability in human liver transplantation. Transplantation，1988, 45:138-143.3，Reckendorfer H, Burgmann H. Spieckermann PG hepatic energy metabolism dur

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