鼠角膜碱烧伤的免疫学研究

1、    鼠角膜碱烧伤的免疫学研究        【摘要】目的探讨角膜碱烧伤后眼局部的免疫反应机制。 方法在大鼠角膜上制作碱烧伤模型。在烧伤后的不同阶段，制备角膜、虹膜组织平片，采用标准的卵白素-生物素过氧化物酶复合物免疫组化(avidin-biotin complex ，ABC)方法，观察眼局部T淋巴细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞、主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）-类抗原阳性细胞的动态变化。结果碱烧伤后早期，角膜及虹膜

2、即有T淋巴细胞浸润，以CD3淋巴细胞为主，MHC-类抗原阳性细胞也轻度增多。在角膜溶解穿孔阶段，T淋巴细胞浸润达到高峰，其中CD4淋巴细胞明显多于CD8淋巴细胞；巨噬细胞、树突细胞、MHC-类抗原阳性细胞大量出现。上述细胞密集分布于角膜缘，其中淋巴细胞及MHC-类抗原阳性细胞可见于角膜溶解处及中央区。在烧伤后期角膜溃疡已进入修复阶段，虹膜上依然可见多量各类阳性细胞。结论免疫反应可能参与了角膜重度碱烧伤后的组织病变过程，在角膜溶解穿孔及眼内炎症的发生中起重要作用。 【关键词】角膜； 烧伤，化学； 模型，免疫学； 免疫组织化学； 平片技术Immunologic experimental studi

3、es on the alkali burn of cornea in ratsZHAO Min（Department of Ophthalmology, First Teaching Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016，China）CHEN Jiaqi, YANG Peizeng.【Abstract】ObjectiveTo investigate the immune reaction of severe corneal alkali burns. Methods The models of

4、severe corneal alkali burns were induced in rats. Immunohistochemistry was carried out on wholemounts of the cornea and iris at different time points after corneal burns to detect T-lymphocytes and their subpopulation, macrophages, dentritic cells and MHC class -positive cells. Results In the early

5、stage of the burns, there were small increasing number of T-lymphocytes and MHC class -positive cells in the cornea and iris. At the period of corneal melting and perforation, a massive influx of lymphocytes (CD3, CD4, CD8), macrophages and dentritic cells was seen in the cornea adjacent to the limb

6、us and iris. CD4 lymphocytes were much more than CD8 in number. T-cells and MHC class -positive cells were observed not only at the limbus but also in the melting area and corneal center. Morphological changes of these cells were also noted. In the restoration stage, a number of positive cells were

7、still found in the iris. ConclusionImmunological mechanism is involved in the pathological changes of the damage induced by corneal alkali burns, especially in the pathogenesis of the corneal melting and perforation.【Key words】Cornea； Burn, chemical； Models，immunology； Immunohistochemistry； Wholemou

8、nt角膜重度碱烧伤后常发生顽固性溃疡，甚至溶解穿孔，在这个病理过程中，免疫学机制是否参与，一直是人们关注的问题；对碱烧伤后是否应用皮质激素治疗也一直存在着争论。为了探讨眼碱烧伤后的免疫反应，我们采用眼组织平片技术，对碱烧伤后的角膜及虹膜组织进行免疫组织化学研究，观察眼局部T淋巴细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞、主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）-类抗原阳性细胞的动态变化。材料和方法一、材料健康SD(sprague dawley)大鼠20只，体重150200 g，鼠龄68周，雌雄各半。二、方法采用0.2 ml氨胺酮+0.1 ml氯丙嗪腹腔注射

9、麻醉，将直径5 mm 的圆形滤纸在1 mol/L NaOH中充分浸透，取出滤纸，吸除滤液，贴于角膜中央烧灼30 s；移去滤纸后，立即用生理盐水冲洗结膜囊，以0.5%新霉素眼液滴眼。1.取组织标本时间：在3个不同时间段取病变组织标本：(1)烧伤早期(2或3 d)；(2)角膜溶解即将穿孔或穿孔初期(712 d，平均8.5 d)；(3)溃疡愈合，新生血管生长，病情稳定时的恢复期(均在14 d以上，平均20 d)。2.标本制作步骤：采用杨培增等1，2所用方法制作眼组织平片。麻醉后，于大鼠左心室内注射106U/L肝素0.3 ml以抗凝血，从左心室插管至主动脉，用250 ml预冷的磷酸缓冲液(phosph

10、ate buffered saline,PBS)灌注，充分排除血管床中的血液成分；摘除眼球，在手术显微镜下从睫状体平坦部切开眼球，分离出虹膜、角膜组织，各取4片，移入100%冷乙醇中固定510 min，再移入0.01 mol/L PBS液中，4贮存备用。免疫组织化学染色采用卵白素-生物素过氧化物酶复合物(avidin-biotin complex, ABC)法。一抗采用小鼠抗大鼠IgG(购自Holland biotechnology公司)，包括抗CD3、CD4、CD8淋巴细胞，树突细胞，巨噬细胞，MHC-II类抗原抗体；二抗采用生物素标记的羊抗小鼠IgG(华美生物制品公司)。眼组织平片ABC法

11、染色主要步骤在24孔培养板中进行；将染色好的组织片平铺于凝胶包被的载玻片上，常规封片；阴性对照以PBS液代替一抗。光镜下观察。结果一、正常眼组织平片正常角膜仅在角膜缘发现少量CD3淋巴细胞(1)、呈圆形的MHC-类抗原阳性细胞及少量可疑的巨噬细胞；正常虹膜上淋巴细胞及MHC-类抗原阳性细胞稍多，呈散在分布(2)，可见CD3、CD4、CD8淋巴细胞，CD4与CD8淋巴细胞比例大致相当；可见少量巨噬细胞和树突状细胞。二、碱烧伤后眼组织平片改变1. 烧伤早期：(1)角膜：角膜缘的淋巴细胞较正常眼增多，以CD3淋巴细胞为主(3),可见少量的巨噬细胞及树突状细胞，后者染色较淡；MHC-类抗原阳性细胞增多

12、，仍以圆形为主。在角膜中央未见上述细胞。(2)虹膜：淋巴细胞、MHC-类抗原阳性细胞较正常眼明显增多，淋巴细胞仍以CD3为主，CD4、CD8淋巴细胞较少；巨噬细胞与树突状细胞染色加深，数量稍有增加，巨噬细胞以中等大小的圆形细胞为主。2.角膜溶解穿孔期：(1)角膜：淋巴细胞显著增多,在角膜缘及角膜周边部数量约为烧伤初期的10倍，在角膜溃疡及溶解区，亦可见少至中等量的淋巴细胞,其中以CD3最多，其次为CD4和CD8淋巴细胞；角膜缘可见大量的巨噬细胞和树突状细胞，密集成堆，难以准确计数，用调焦的方法发现这些细胞分布于角膜各层，由角膜缘向角膜中央逐渐减少(4)；在角膜溶解穿孔附近及角膜缘，可见多量MH

13、C-类抗原阳性细胞，其形态由烧伤初期的圆形变为多形性(5)。(2)虹膜：可见大量的CD3、CD4及CD8淋巴细胞(6)，CD4淋巴细胞明显多于CD8；巨噬细胞和树突状细胞在虹膜根部较多，树突状细胞的突起长而粗大且增多(7)；MHC-类抗原阳性细胞除数量显著增多外，形态也呈多样性，大小不一(8)。3.恢复期：除MHC-类抗原阳性细胞在角膜缘分布较正常眼增多外，角膜平片其它阳性细胞均逐渐减少；但在虹膜平片上，仍可见大量的CD3、CD4及少量的CD8淋巴细胞，即使在烧伤后30 d，虹膜平片上淋巴细胞及MHC-类抗原阳性细胞仍显著多于正常对照组。讨论一、角膜碱烧伤溃疡溶解的机制既往研究认为，角膜重度碱

14、烧伤后出现的反复性角膜溃疡、溶解穿孔，其发生机理主要是碱烧伤后胶原酶对角膜胶原的不断消化，以及氧自由基对角膜细胞的毒性破坏。这两个因素都与多形核白细胞的浸润有关。角膜溶解穿孔时正是多形核白细胞浸润的高峰，与此同时淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞也增多,并出现体液免疫反应的高峰，因此有文献报道免疫机制可能参与了眼碱烧伤的病理过程3。但迄今为止，相关的研究很少。二、眼组织平片免疫组织化学染色技术的优越性我们采用眼组织平片免疫组织化学染色方法，首次观察了眼部碱烧伤后不同阶段T淋巴细胞亚群、巨噬细胞、树突状细胞、MHC-类抗原阳性细胞的动态变化。眼组织平片免疫组织化学染色技术是近年问世的一种研究方法4，在对

15、葡萄膜炎动物模型的研究中显示出其独特的优越性1,2,4。我们首次将该技术应用于眼碱烧伤的研究，发现组织平片较切片更容易观察阳性细胞的数量、分布以及形态学变化。碱烧伤初期，T淋巴细胞开始浸润，MHC-类抗原阳性细胞轻度增多。角膜溶解穿孔阶段，T淋巴细胞大量浸润，尤其在虹膜平片上可见较密集的淋巴细胞，在T淋巴细胞亚群内，CD4明显多于CD8；巨噬细胞、树突状细胞、MHC-类抗原阳性细胞大量出现并有形态学的改变。即使到碱烧伤晚期,在虹膜上依然可见这些细胞改变。三、角膜碱烧伤的免疫反应表达上述细胞的改变很难用一般炎性反应机制解释。众所周知，巨噬细胞是机体内重要的防御细胞，除了利用吞噬作用参与非特异性免

16、疫反应外，还通过提呈抗原或分泌一些细胞活素发挥其特异性免疫调节作用。树突状细胞(在角膜主要为Langerhans细胞)与巨噬细胞有类似的作用，有作者观察到碱烧伤后Langerhans细胞在角膜缘明显增多，并有向中央移行的趋势5。MHC-类抗原表达于抗原递呈细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、活化的T细胞、成熟的B细胞，在免疫应答及调节过程中起着重要的作用。Thiel等6在碱烧伤患者的角结膜中，发现MHC-类抗原的异常表达。正常情况下，角膜中央无MHC-类抗原阳性细胞2，但在某些特殊情况下，角膜细胞可以表达MHC-类抗原7。这些异常表达MHC-类抗原的细胞，一方面可能受到MHC-限制的细胞毒性T淋巴细

17、胞的攻击而受损伤，另一方面本身还可起到抗原提呈细胞的作用，将自身抗原提呈给辅助性T淋巴细胞，引起自身免疫反应，造成自身组织的损伤。T淋巴细胞除了数量增多外，亚群的变化也极有意义，CD4淋巴细胞（Th/Ti）和CD8淋巴细胞(Ts/Tc)是T淋巴细胞中两个主要亚群，正常情况下处于平衡状态,在角膜溶解的组织中CD4/CD8比值增高8。本研究发现，在碱烧伤初期这两群细胞的数量无明显差别；随着病情的发展，在角膜溶解穿孔期,可见CD4淋巴细胞较CD8明显增多，在虹膜上的表现更为突出；即使到了碱烧伤的晚期这两群细胞的改变亦是如此。CD4淋巴细胞的增多，说明免疫反应过强，并可能与自身免疫反应有关。在临床上，

18、眼部组织碱烧伤后的改变是个长期过程，除了角膜反复糜烂溃疡外，眼内葡萄膜炎亦久治不愈。在本研究中我们观察到，在角膜溃疡修复、大量新生血管生长的病变稳定阶段，虹膜平片上依然可见多量的各种阳性细胞，尤其是T淋巴细胞和MHC-类抗原阳性细胞。在另一组研究资料中，我们观察了视网膜和脉络膜组织平片，发现了类似改变。这提示眼组织碱烧伤后的慢性炎症亦与免疫反应有关，其造成的损伤进一步加重了碱烧伤后眼组织的病变，重者可致眼球萎缩。当然，碱烧伤后眼部的病理改变是一个复杂过程，有多方面的机制参与，免疫反应只是其中的一个重要环节，它与其它因素之间的关系（如胶原酶、氧自由基等）尚待深入研究。1正常角膜平片,角膜缘CD3

19、+3淋巴细胞×2002正常虹膜平片,散在分布的CD3+4淋巴细胞×2003碱烧伤第3天,角膜缘浸润的CD3+3淋巴细胞×2004碱烧伤第8天,角膜缘密集成堆的巨噬细胞,向角膜中央逐渐减少×4005碱烧伤第10天,角膜缘MHC-II类抗原阳性细胞形态大小不一×4006碱烧伤第8天,虹膜平片大量树突细胞,可见长而粗大的突起×2007碱烧伤第10天,虹膜平片大量树突细胞,可见长而粗大的突起×2008碱烧伤第10天,虹膜平片MHC-II类抗原阳性细胞形态不规则×400（本文18见插页第4页）基金项目：美国中华医学基金会资助

20、项目（93-594）作者单位: 赵敏（重庆医科大学第一医院眼科400016）陈家祺（中山医科大学中山眼科中心）杨培增（中山医科大学中山眼科中心）参考文献1Yang P, de Vos AF, Kijlstra A. Macrophages in the retina of normal Lewis rats and their dynamics after injection of lipopolysaccharide.Invest Ophthalmol Vis Sci， 1996，37:77-85.2杨培增，de Vos AF, Kijlstra A.内毒素在Lewis鼠诱导的角膜改变. 眼科学报， 1996，12:70-74. 3林荣霞眼部化学碱性烧伤的免疫学研究.国外医学眼科学分册，1989，13:84-87.4McMenamin PG, Crewe J, Morrison S, et al. Immunomorphologic studies of macrophages and MHC class-positive dendritic cells in the iris and ciliary body of the r