铁脂质体的制备及其体外释放研究

1、 第 41卷 /第 1期 /2017年 1月 河北师范大学学报 /自然科学版 /JOURNAL OF HEBEI NORMAL UNIVERSITY /Natural Science Edition /Vol41No1Jan2017文章编号 :10005854(2017 01005806收稿日期 :20150526; 修回日期 :20151211基金项目 :国家自然科学 青年 基金 (31201305 ; 河北 省自然科学基金 石药 集 团 医 药 联 合研究基金 (C2012205082作者简介 :李 妮娜 (1990 , 女 , 河北 衡 水 人 , 硕 士研究生 , 研究方向为 功 能

2、纳米脂 质 体的 制 备 及 应用 通 信 作者 :耿 丽 娜 (1976 , 女 , 副教授 , 硕 士生 导 师 , 研究方向为 载 药 脂 质 体 Email :genglina0102126com 铁脂质体的制备及其体外释放研究李妮娜 1, 李亚永 2, 王 琳 1, 常彦忠 3, 耿丽娜1(1河北师 范 大学 化学与 材 料科学学院 , 河北 石 家 庄 050024; 2石 家 庄 市 第 一 医 院 内 科 , 河北 石 家 庄 050000;3河北师 范 大学 生 命 科学学院 , 河北 石 家 庄 050024摘 要 :铁 是 人 体 必需 的 微 量 元素 之 一 , 铁缺

3、乏会 导致 贫 血 等 疾病 ,而 常 规补铁 剂 具有 吸 收率 低 、 有 毒 性 等 缺 点 采 用 薄膜旋 转 蒸 发 法 和 乙 醇 注 入 法 , 成 功 制 备 了 柠檬 酸 铁脂 质 体 (FAClip 和 血 红素 铁脂 质 体 (HEMElip 采 用动 态 光 散 射 (DLS 、 透 射 电 镜 (TEM 对 铁脂 质 体进行 了 表征 , 并进行体外 释 放 研究 结果表明 ,铁脂 质 体 都呈 球 形 、 具有连 续膜 结构 和 缓 释 性 , 且 药 物 的分子 量 、 结构 、 与 膜 层 作 用 力 及 脂 质 体的 粒径 大 小 对 脂 质 体的 药 物 释

4、 放都有 影响 关键词 :柠檬 酸 铁 ; 血 红素 铁 ; 脂 质 体 ; 体外 释 放 ; 缓 释 性中图分类号 :R 94文献标志码 :A doi :1013763/jcnkijhebnunse201701011Preparation and in Vitro Release Study of Iron LiposomesLI Nina 1, LI Yayong 2, WANG Lin 1, CHANG Yanzhong 3, GENG Lina 1(1College of Chemistry and Material Sciences , Hebei Normal University

5、 , Hebei Shijiazhuang 050024, China ;2Department of Internal Medicine , the First Hospital of Shijiazhuang , Hebei Shijiazhuang 050000, China ;3College of Life Science , Hebei Normal University , Hebei Shijiazhuang 050024, China Abstract :Iron is one of the essential trace elements of all organisms

6、and iron deficiency can lead to anemia , but the conventional iron agents have many disadvantages , such as low efficacy and certain toxicityIn this study , ferric citrate liposomes (FAClip and heme liposomes (HEMElip are prepared successfully by rotaryevaporated filmultrasonication method and ethan

7、ol injection methodThe prepared iron liposomes are characterized by dynamic light scattering (DLS and transmission electron microscope (TEM and studied the release in vitroThe results showed that iron liposomes are all spherical shape and had continous membranesMeanwhile , the iron liposomes have co

8、ntrolledrelease properties , and the molecular mass and structure of drugs and the particle sizes of liposomes all can affect the release in vitroKey words :FAC ; HEME ; liposome ; release in vitro ; control release铁 是 人 体 必需 的 微 量 元素 之 一 , 在 机 体 活 动和生物 代谢 中 起 着 非 常 重 要 的作 用 目 前 , 铁缺乏症 是 全 球性 营 养 缺乏

9、 疾病 , 全 世界 约 有 20多 亿 人 存 在 不同 程 度 的 铁缺乏症 , 11多 亿 人 患缺铁 性 贫 血 , 世界卫 生 组织已 将 缺铁 性 贫 血 列 为 全 球 四 大 营 养 性 疾病 之 一12铁缺乏症 通 常是 由于 摄 入 含 铁 食 物 不 足 、 对 食 物中 铁 的 利 用 度 低 或铁消耗 过多 造 成 的34, 因 此 口 服补铁 剂 或增 加 食 物中 铁 含 量是 预防铁缺乏症 最好 的 可 持 续 发 展 的 方 法 57目 前 , 常 用 的 补铁 剂 主要 是 小 分子有 机 酸 铁 盐 , 如 葡萄 糖 酸 亚 铁 、 柠檬 酸 铁 、血 红

10、素 铁 、 乙 二胺四 乙 酸 铁钠 等 , 一 般 通过 口 服 方 式 进行 补铁 , 但 存 在 口 感 差 、 副 作 用大 、 吸 收率 低 、 有 毒 性 等 缺 点 8, 同 时 柠 檬 酸 铁 和 血 红素 铁 对 光 和热 敏 感 , 不 稳定 , 因 此 , 寻找 一种 新 的 治疗 缺铁 性 贫 血 的 补铁 剂 势 在 必 行 脂 质 体 (liposome 是近年来 出 现 的一种 新 型 药 物 载 体 , 具有 类 细 胞的 双 分子 层 结构 , 无 毒 、 无 免疫 原 , 可 作 为 亲 水 性 、 疏 水 性 或 是 两 性 物 质 的 载 体910, 用

11、 于 药 物 、 质 粒 、 多 肽 、 蛋白 、 病 毒 、 细菌 等 1112多种 物 质 的 载 运 , 还 具有 靶 向 性 、 低 毒 性 、 生物 可降解 性 、 增 溶 难 溶物和 长 效 缓 释 性 等 优 点 13, 在 药 物 载 体 中 脱 颖 而 出 在 笔者前 期 实验 的 基 础 上 14, 本文 以 脂 质 体作 为 常 规补铁 剂 的 载 体 , 采 用 薄膜旋 转 蒸 发 法 和 乙 醇 注 入 法制 备 铁脂 质 体 , 通过 优 化 卵磷脂 /胆 固 醇 、 药 物 /卵磷脂 的 比 例 及 超 声 时 间 , 制 备 出 包封率 高 的 铁脂 质 体 ;

12、 采 用动 态 光 散 射 、 透 射 电 子 显微 镜 (TEM 等 技术 对 铁脂 质 体进行表征 , 并 考 察 了 药 物 分子 大 小 、 脂 质 体 粒径 大 小 对 载 药 脂 质 体体外 释 放 的 影响 1材料 与 方法 11材料与主要设备 111实验 材 料水 溶 性 柠檬 酸 铁 (FAC , 美 国 Sigma 公司 ,水 溶 性 血 红素 铁 (HEME , 和 田龙 生物科 技 公司 , 大 豆卵磷脂 (北 京 华 美 磷脂 科 技 有 限公司 , 胆 固 醇 (北 京 鼎 国生物 技术 发 展 中 心 ; 其 他试 剂 均 为 分析 纯 (生物科 技 发 展 有

13、限公司 112仪 器 与 设备U 3010紫 外 可见 分光光 度 计 (日 本 日 立 公司 ,CPS2超 声 波 粉 碎 机 (宁 波 新 芝 超 声 有 限公司 , 852恒 温 磁 力 搅拌器 (常 州 澳华 仪 器 有 限公司 ,TGL 18B 高 速 离 心 机 (湖南星 科科学 仪 器 有 限公司 , ZHWY 200B 恒温 培 养 振 荡 器 (上 海 智诚 分析 仪 器 制 造 有 限公司 , 微 量 移 液器 (德 国 Eppendorf 公司 ,JEM100SX 透 射 电 子 显微 镜 (日 本 日 立 公司 ,ZetaSizer Nano ZS (英 国 马 尔 文

14、公司 12实验方法 121薄膜旋 转 蒸 发 法制 备 FAClip1和 HEMElip 13按 比 例 称取 大 豆卵磷脂 和 胆 固 醇 (质 量 比 分 别 为 8 1, 10 1, 12 1 , 溶 于 10mL 无 水 乙 醇 中 , 置 于 旋转 蒸 发仪 上 45 真 空 旋 转 成 膜 取 柠檬 酸 铁 (血 红素 铁 的 PBS 溶 液 10mL ,倒 入 上述 成 膜 的 圆底烧瓶 中 , 旋 转 40min , 直 至 成为 均 匀 的 混 悬 液 分 别 超 声 处 理 10, 15, 20min , 将处 理 后 的 混 悬 液置 于 透 析 袋 中 (MWCO350

15、0 纯 化 , 避 光 透 析 4 5h将所得 产 物 置 于 4 冰 箱 中 , 保 存 备 用 122乙 醇 注 入 法制 备 FAClip2按 比 例 称取 大 豆卵磷脂 和 胆 固 醇 (质 量 比 分 别 为 4 1, 6 1, 8 1, 10 1 , 溶 于 2mL 无 水 乙 醇 中 将 盛有 8mL 柠檬 酸 铁 溶 液 的 烧杯 置 于 水 浴 中 , 边 搅拌 边匀 速 滴 加 卵磷脂 和 胆 固 醇的 混 合 液 ,直 至 乙 醇 挥 发 完 全 , 即 可得 到 FAClip2分 别 超 声 处 理 5, 10, 15, 30min , 将处 理 后 的 混 悬 液置

16、于 透 析 袋 中 (MWCO 3500 纯 化 , 避光 透 析 4 5h将所得 产 物 置 于 4 冰 箱 中 , 保 存 备 用 123脂 质 体 包封率 的测定准确称取 柠檬 酸 铁 (血 红素 铁 标准 品 , 配 置 一系 列 浓 度 的 标准 溶 液 , 用 紫 外 分光光 度 计 分 别 测 试 其 在 260nm (393nm 处 的 吸 光 度 , 得 到 柠檬 酸 铁 和 血 红素 铁 的 工 作 曲 线分 别是 :A =1296C 007299(R =09994 和 A =5794C 008084(R =09992 取 1mL FAC lip (HEMElip 于 10

17、mL 离 心 管 中 , 加入 1mL 的 二甲苯 破乳 , 充分 混 匀 后 , 先 用 3500g 离 心 20min , 再 用 4000g 离 心 10min弃 去 上 清 , 下 层 即 为 柠檬 酸 铁 (血 红素 铁 溶 液 用 紫 外 可见 分光光 度 计 分 别 测 试 260nm (393nm 处 的 吸 光 度 , 再 代 入 工 作 曲 线 , 即 可得 到 脂 质 体 所包封 的 柠檬 酸 铁 (血 红素 铁 的 量 然 后 根 据 公式 (1 计 算 , 得 到 铁脂 质 体的 包封率 (EE% 包封率 =脂 质 体 中 包封 的 药 物 量 /反 应中 所加入 的

18、 药 物 总 量 100%(1124铁脂 质 体的形 态 和 粒径 分 布 测定 用 滴 管 吸取 1滴 经 稀 释 的 铁脂 质 体 , 滴 在 镀 膜 的 铜 网表面 , 自然 晾干 , 再 用 质 量 分数 为 4%磷 钨 酸溶 液 对 脂 质 体进行 负染 , 用 滤 纸 从 铜 网 边缘 吸 干 多 余 的 负染 液 , 染 色 30s , 之 后将 铜 网 自然 晾干 , 置 于 透 射 电 镜 下·95 ·观察 铁脂 质 体的 微 观 形 貌 取 01mL 铁脂 质 体 , 用二 次 蒸 馏 水 稀 释 10倍 , 使 用 激 光 粒 度仪 分 别 测定 铁脂

19、 质 体的 粒径 分 布 125铁脂 质 体的体外 释 放取 FAClip1, HEMElip 和 FAClip2各 2mL , 分 别 与 相 同 体 积 的 胃 液 或 肠 液 混 合 (胃 液 pH =13, 含有胃 蛋白酶 的 PBS 缓 冲 溶 液 ; 肠 液 pH =75, 含有 胰 脂 肪 酶 的 PBS 缓 冲 溶 液 , 将 混 合 液 注 入 透 析 袋 (MWCO 3500 , 并 放入装 有 100mL 释 放 介 质 的 烧 杯 中 , 杯 口 用 锡 箔 纸 密 封 ,置 于 恒 温 培 养 振 荡 器 内 , 在 37 , 60r /min转 速 下 测定 铁脂

20、质 体的体外 释 放 在 一定的 时 间间 隔 取 透 析 液 1mL , 同 时 补 充相 同 体 积 的 新 鲜 释 放 介 质 以 释 放 介 质 为 空 白 对 照 , 使 用 紫 外 可见 分光光 度 计 测定 透 析 液 中 柠檬 酸 铁或 血 红素 铁 的含 量 , 按 公式(2 计 算 累 积 释 放 量 累 积 释 放 量 =一定 时 间 释 放 出 的 药 物 总 量 /脂 质 体 包封 的 药 物 总 量 100%(2 2结果与讨论 21铁脂质体的制备条件优化本 实验 通过单 因 素 实验 考 察 了 卵磷脂 /胆 固 醇 、 药 物 /卵磷脂 的 质 量 比 及 超 声

21、 时 间 对 包封率 的 影响 (见 图 1a , b , c 胆 固 醇 是 许 多 天 然生物 膜 的 组 成成 分 , 可 以 改 变 膜 的 流 动 性 和 通 透 性 在 制 备脂 质 体 时 , 卵磷脂 和 胆 固 醇 混 合 可 以 提 高 膜 的 完 整 性 , 同 时 提 高 脂 质 体的 包封率 和 稳定性 15从 图 1可 以 发 现 , 当 大 豆卵磷脂与 胆 固 醇的 质 量 比 为 10 1时 ,FAClip1和 HEMElip 的 包封率最 高 (图 1中 a1, b1 ; 其 质 量 比 为 8 1时 (图 1中 c1 , FAClip2的 包封率最 高 卵磷脂

22、 量 一定 时 , 脂 质 体 包封 药 物 的 量是 有 限 的 , 当 包封率 达 到 最 大时 , 随 着 药 物 的 增 加包封率 会 逐渐 下 降 图 1中 a2, b2, c2显 示 , 当 药 物与 卵磷脂 的 质 量 比 分 别 为 1 65,1 6, 1 10时 , FAClip1, HEMElip 和 FAClip2分 别 具有 最 大 包封率 此外 , 超 声 时 间 对 脂 质 体的 包封率 也 起着 至关 重 要 的作 用 (图 1中 a3, b3, c3 , 超 声 时 间 短 , 脂 质 体的 粒径 大 ; 超 声 时 间过 长 , 又 会 使 脂 质 体 破 裂

23、 , 导致 包封率 下 降 当超 声 时 间分 别 为 20,15, 10min 时 , FAClip1, HEMElip 和 FAClip2分 别 具有 最 大 包封率 ·06 · aHEMElip1; bHEMElip ; cFAClip2图 1制备条件优化及对包封率 的 影响22铁脂质体的表征图 2是 铁脂 质 体的 透 射 电 镜 照 片 可 以 看出 , 铁脂 质 体 粒径 分 布 比 较 均 匀 , 呈 圆 球 形 , 并 且 具有连 续膜 的 结构 采 用 激 光 粒 度 分 布 仪 测 试 铁脂 质 体的 粒径 分 布 (见图 3 从 图 3可 以 看出 ,

24、 铁脂 质 体的 粒径 都比 较 小 , FAClip1, HEMElip 和 FAClip2的 粒径 分 别 为 150, 60, 58nm其 中 , 采 用 薄膜旋 转 蒸 发 法 和 乙 醇 注 入 法 所得 到 的 FAClip1(图 3a 和 FAClip2(图 3c 粒径 明 显 不同 , 这 与 文 献 16的 报道 一 致 , 即 乙 醇 注 入 法制 备的 脂 质 体 粒径 均 偏 小 , 并 且 稳定性 好 而 采 用 薄膜旋 转 蒸 发 法制 备 的 HEMElip 的 粒径 也 很小 , 约 为 60nm , 这可 能 是 由于 水 溶 性 血 红素 铁 具有 平 面的

25、 卟啉 环 结构 , 上面的 COO 基 团 与 磷脂 分子的 亲 水 头 部 有 更 强的作用 力 所 致 17Lu 等 18报道 , 载 药 脂 质 体的 大 小 对 体 内 药 效 有 显 著 的 影响 , 小 粒径 的 粒 子 (200nm 可 以 增加 血管 的 渗 透 性 , 并 且 能 够提 高药 物 的 利 用 率 在 本 实验中 制 备 的 铁脂 质 体 粒径 均 200nm , 其 中 FAClip2和 HEMElip 的 粒径 100nm , 因 此 , 本 实验 制 备 的 铁脂 质 体 适 合 于体 内 递送 药 物 aFAClip1; bHEMElip ; cFAC

26、lip2图 2铁脂质 体的 负染电镜 图aFAClip1; bHEMElip ; cFAClip2图 3铁脂质 体的 粒径 分 布·16 ·23铁脂质体的体外释放铁脂 质 体 在 胃 液 和 肠 液 中 的 释 放曲 线 如图 4所示 , 可 以 看出 , 在 胃 、 肠 液 中 分 别 释 放 不同 的 时 间 , 铁脂 质体的 累 积 释 放 量 变 化 趋 势 一 致 , 即 FAClip1FAClip2HEMElip其 中 , FAClip1和 FAClip2粒径 不 同 , 释 放 35h 时 , FAClip1在 胃 、 肠 液 中 累 积 释 放 量 分 别

27、为 9743%和 7226%, 均 大 于 FAClip2的 5026%和 6572%, 这 是 由于 粒径 对 载 药 脂 质 体的 释 放 有 影响 , 小 粒径脂 质 体 缓 释 性 更 好 18而 对 于 与FAClip2粒径 相当的 HEMELip , 在 35h 时 , 其 在 胃 、 肠 液 的 累 积 释 放 量 分 别 为 282%和 452%, 释 放速 度更 缓慢 , 缓 释 性 更 好 , 可 能 是 由于 血 红素 铁 的分子 量 (65196 较 柠檬 酸 铁 分子 量 (24494 大 , 其 与 膜 层 之 间 的作 用 力 也 大 于 柠檬 酸 铁 与 膜 层

28、 之 间的作 用 力 所 致17体外 释 放 结果表明 , 实验中 制 备 的 铁脂 质 体 都 具有 缓 释 性 , 同 时 结 合 前 期 的 实验 结果17可知 , 药 物 的分子 量 、 结构 、 与 膜 层 作 用 力 及 脂 质 体的 粒径 大 小 对 脂 质体的 药 物 释 放都 有 影响 a胃 液 ; b肠 液 图 4铁脂质 体的体外 释放 曲线3结束语采 用 薄膜旋 转 蒸 发 法 和 乙 醇 注 入 法 , 成 功 制 备 了 柠檬 酸 铁脂 质 体 (FAClip 和 血 红素 铁脂 质 体 (Hemelip , 采 用动 态 光 散 射 (DLS 、 透 射 电 镜 (TEM 对 铁脂 质 体 做 了 表征 , 并进行 了 体外