人胆固醇酯转运蛋白的cDNA克隆、 原核表达及抗血清制备

1、人胆固醇酯转运蛋白的cDNA克隆、 原核表达及抗血清制备         11-01-31 10:37:00     作者：刘惠荣     编辑：studa20【摘要】  目的: 克隆人胆固醇酯转运蛋白（CETP） cDNA序列, 利用大肠杆菌表达人CETP, 制备兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法: 采用RTPCR方法, 将人CETP基因克隆到pET30b(+)上, 构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌, IPTG诱导表达

2、, 切胶纯化蛋白后免疫家兔, 制备CETP抗血清, 以ELISA、 Western blot、 细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果: SDSPAGE分析表明, 经IPTG诱导, CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达, 最佳诱导表达时间为4 h。将切胶纯化的蛋白免疫家兔, ELISA法测定的抗血清效价为15.12×105。Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示, 抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合。结论: 成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、 高特异性的兔抗人CETP抗血清, 为进一步研究CETP的结构与功能奠定了

3、基础。 【关键词】  胆固醇酯转运蛋白 原核表达 抗血清Abstract  AIM: To clone human cholesteryl ester transfer protein (CETP) cDNA, express and purify human CETP in E.coli and prepare CETPspecific rabbit antiserum. METHODS: by RTPCR method, the encoding sequence of human cholesteryl ester transfer protein (CETP) wa

4、s cloned into pET30b(+) vector. Then BL21 (DE3) of E.coli transformed with recombinant vector pETCETP was induced to express CETP in high level by IPTG. The expressed protein was purified from SDSpolyacrylamide gel, and the antiserum against CETP was raised in rabbit. The titer and specificity of ra

5、bbit antiserum were evaluated by ELISA, Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The results of SDSPAGE showed that CETP was expressed in the form of inclusion bodies in  BL21(DE3) and the best expression time was about 4 hours. The titer of the rabbit antiserum prepared with CETP pu

6、rified from SDSPAGE was 15.12×105 and the antiserum reacted specifically with CETP expressed in BL21 (DE3) and COS7 cells. CONCLUSION: The preparation of the specific rabbit antiserum against CETP will be valuable for the study on the structure and function of human CETP.Keywordscholesteryl est

7、er transfer protein; prokaryotic expression; antiserum摘 要 目的: 克隆人胆固醇酯转运蛋白（CETP） cDNA序列, 利用大肠杆菌表达人CETP, 制备兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法: 采用RTPCR方法, 将人CETP基因克隆到pET30b(+)上, 构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌, IPTG诱导表达, 切胶纯化蛋白后免疫家兔, 制备CETP抗血清, 以ELISA、 Western blot、 细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果: SDSPAGE分析表明, 经IPTG诱导, CETP基因在大肠杆菌BL21(

8、DE3)的包涵体中高效表达, 最佳诱导表达时间为4 h。将切胶纯化的蛋白免疫家兔, ELISA法测定的抗血清效价为15.12×105。Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示, 抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合。结论: 成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、 高特异性的兔抗人CETP抗血清, 为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础。关键词胆固醇酯转运蛋白; 原核表达; 抗血清    人胆固醇转运蛋白（cholesteryl ester transfer protein, CETP）是一个极度疏水的糖蛋白, 包含476个

9、氨基酸, 非极性氨基酸占45%1。在逆向胆固醇转运中, CETP促进胆固醇酯从高密度脂蛋白（HDL）转运到含载脂蛋白B（apoB）的脂蛋白颗粒中, 同时反向转运甘油三脂, 因参与了血浆脂蛋白胆固醇水平的调控和脂蛋白颗粒的重塑, CETP在脂蛋白代谢中的作用近年来倍受重视2。然而, 到目前为止, 尽管人们已经获得了几种CETP的抑制剂3, 但对CETP究竟是抗动脉粥样硬化(AS)因子还是致AS因子一直存在争议。在逆向胆固醇转运中, HDL颗粒内的胆固醇酯被CETP转运到含apoB的脂蛋白中, 随后, 这些脂蛋白被肝吸收分解, 由于促进了外周组织多余胆固醇向肝的运送, 避免了胆固醇在血管内的富集,

10、 CETP被认为是抗动脉粥样硬化的。然而, 另一方面, 这个过程直接导致了具有抗动脉粥样硬化作用的高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)水平的下降, 因此, CETP又被认为是促动脉粥样硬化的。大量的流行病学及动物研究显示, CETP抗动脉粥样硬化和促动脉粥样硬化特性之间可能存在内在平衡, 其确切功能依赖于代谢环境和遗传背景1。 我们在已发表的人CETP cDNA序列基础上, 通过RTPCR方法扩增得到CETP成熟蛋白编码序列并克隆到原核表达载体中, 化学诱导重组蛋白的高效表达, 并制备出相应的特异性抗血清, 为深入研究CETP在AS中的确切功能以及CETP蛋白水平的检测等奠定了基础。1 

11、材料和方法1.1  材料 人肝组织来自北京协和医院外科肝部分切除的手术标本。新西兰大耳白兔(雄性, 体质量2.53.0 kg)购自中国药品生物制品检定所。pET30b(+)质粒载体购自Novagen公司。BL21(DE3)菌株为本室冻存。限制性内切酶及pyrobest DNA聚合酶等工具酶购自TaKaRa公司。SuperScript FirstStrand Synthesis System for RTPCR及pcDNA3.1/mycHis(-)A质粒购自Invitrogen公司。弗氏完全佐剂、不完全佐剂和DMEM培养基购自Gibco公司。蛋白标准购自Fermentas公司

12、。COS7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。高效真核转染试剂盒购自威格拉斯仪器有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司。ECL化学发光试剂盒及HRP和FITC标记的山羊抗兔二抗购自Santa Cruze公司。1.2  方法提取人肝组织总RNA并纯化mRNA, 将mRNA反转录成cDNA, 根据参考文献4中的人CETP cDNA序列设计引物: 5GGAATTCCATATGTGCTCCAAAGGCACCTCGC3（含Nde I位点和起始密码子）; 5ACGCGTCGACGCTCAAGCTCTGGAGGAAATCCAC3（含Sal I位点和终止密码子）。用Pyrobe

13、st DNA polymerase进行PCR: 94 4 min; 94 1 min, 56 1 min, 72 3 min, 2 个循环; 94 1 min, 68 1 min, 72 3 min, 28 个循环, 最后72延伸10 min, 得到人CETP RTPCR产物, 用于后续实验。将PCR产物电泳回收后, 与pET30b(+)质粒同时进行Nde 和Sal I双酶切。将酶切后的PCR产物与载体连接, 转化入大肠杆菌BL21（DE3）, 小量提取质粒进行PCR鉴定, 鉴定引物为: 5CCAGCAGCCAGGTGGAGC3, 5GGAGGTCCTCTGAGACATTCTTG3。将PCR鉴

14、定为阳性的克隆送北京三博远志生物有限公司测序。将CETP原核表达载体pETCETP转化大肠杆菌BL21(DE3), 挑取单克隆进行IPTG诱导表达（1 mmol/L）, 收集菌体, 超声破碎, 离心, 分别将上清和沉淀进行SDSPAGE电泳分析, 确定CETP的表达形式, 之后将CETP原核表达菌株分别诱导表达07 h, 超声破碎菌体后进行SDSPAGE电泳, 以确定最佳诱导表达时间。将pETCETP转化菌株进行大量诱导表达, 离心收菌, 超声破碎, 收集并洗涤包涵体, 用8 mol/L尿素溶解后进行SDSPAGE电泳分离。从胶的两边分别切一条胶, 于速染液中染色约10 min, 脱色。比照染色的两边胶条, 将未染色胶对应于目的蛋白的部分切下来, 捣碎。加入适量的TrisHCl buffer（10 mmol/L, pH8.0）, 4摇床上摇摆过夜。收集上清, SDSPAGE电泳鉴定蛋白纯度,定量后冻存于-20, 作为免疫原。用1 mg/kg抗原加等体积完全弗氏佐剂以背部皮内多点注射进行基础免疫, 2周后用0.5mg/kg抗原加不完全佐剂进行加强免疫, 以后间隔710d加强1次, 加强2次后取耳缘静脉血, 用间接ELISA法进行抗体效价检测。效价>14000时动脉放血, 43500 r/min离心10