硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中STAT3P38MAPK活化

1、硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中STAT3/P38MAPK活化及端粒酶hTERT-mRNA表达的研究(1) 作者：周永列，吕亚萍，吕火祥，邱莲女，王文松，林惠君，刘建栋【摘要】 为了研究外源性一氧化氮供体硝普钠（SNP）诱导K562细胞凋亡过程中STAT3及P38MAPK活化及端粒酶hTERT-mRNA表达的变化，探讨硝普钠诱导K562细胞凋亡机制，用Annexin-V/PI双标记、DNA片段原位末端标记法、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析等方法检测细胞凋亡。用流式细胞术测定经硝普钠干预后K562细胞磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达，同时利用实时荧光PCR定量检测端粒酶hT

2、ERT-mRNA表达的变化。结果表明： K562细胞经硝普钠作用后出现典型的细胞形态改变，DNA片段化，显现亚G1峰并显著增加。Annexin-V/PI和DNA片段原位末端标记表达增加。这些均证实NO能诱导K562细胞凋亡，大部分细胞阻滞于G0/G1期。SNP诱导K562细胞凋亡过程中，磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达随SNP浓度的增加而表现为先增强后下降；K562细胞与2.0 mmol/L SNP孵育不同的时间内，磷酸化P38MAPK的表达在12小时时达到高峰并持续至48小时，72小时后表达下降；磷酸化STAT3的表达在24小时时达高峰，48小时后表达即显著下降；端粒酶hTERT

3、-mRNA的表达随SNP作用的浓度增加和时间延长而显著下调。结论：SNP能诱导K562细胞凋亡，其机制可能与P38MAPK的活化、抑制端粒酶逆转录酶和STAT3的活化有关。 【关键词】 硝普钠；一氧化氮；K562细胞；细胞凋亡；STAT3；P38MAPK；端粒酶；hTERT-mRNAEffects of Sodium Nitroprusside on P38MAPK/STAT3 Activation and Telomerase Reverse Transcriptase mRNA Expression in Inducing Apoptosis of K562 Cell LineAbstra

4、ct This study was aimed to investigate the activation of P38MAPK/STAT3 and expression of telomerase reverse transcriptase during sodium nitroprusside (SNP) inducing apoptosis of human leukemia cell line K562 and to explore the molecular mechanisms of SNP-inducing apoptosis in K562 cells. The K562 ce

5、ll were treated with different concentrations of SNP and were cultured for different time. Cell apoptosis was analysed by cell morphology，DNA agarose gel electrophoresis， DNA content，and Annexin-V/PI labeling method. The TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay was used to quantitate the in

6、 situ cell apoptosis. The expressions of phosphorylated p38MAPK or STAT3 were analysed by flow cytometry，while the expression of hTERT mRNA in transcriptional level was measured by fluorescence quantitative RT-PCR. The results showed that SNP inhibited K562 cell growth. The K562 cell apoposis was co

7、mfirmed by typical cell morphology and DNA fragment，peak of sub-G1 phase，TUNEL and Annexin-/PI labeling. A majority of K562 cells were arrested in G0/G1 phase. After treatment with SNP at 0.5-3.0 mmol/L，the expression of phosphorylated-P38MAPK and phosphorylated-STAT3 increased first and decreased a

8、fterwards. Incubation of K562 cell with SNP (2 mmol/L) could increase the expression of phosphorylated-P38MAPK and phosphorylated-STAT3 at 12 hours and 24 hours respectively，and down-regulated at 72 hours and 48 hours. SNP could decrease the expression of hTERT-mRNA in time-and dose-dependent manner

9、. It is concluded that SNP can significantly induce K562 cells apoptosis，its mechanism may be related to the activation of P38MAPK and suppression of phosphorylated-STAT3 and hTRET-mRNA.Key words sodium nitroprusside; nitric oxide; K562 cell; apoptosis; STAT3; P38MAPK; telomerase; hTERT mRNA 有丝分裂原激活

10、蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信号通路参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等生理过程和细胞恶性转化等病理过程。P38MAPK是MAPK家族的重要成员，可被多种因子和环境应激反应激活，介导细胞增殖、分化和凋亡。STAT3是信号转导和转录活化因子（signal transducers and activators of transcription，Stats）家族中的重要成员，接受生长因子、细胞因子的刺激，调节细胞的生长、分化、恶性转化和凋亡2，3。端粒酶对于细胞的永生化、凋亡、恶性转化和衰老等起着重要作用，在绝大多数肿瘤细胞中端粒

11、酶活性表达显著增加。以端粒酶作为治疗靶点，抑制端粒酶活性可为临床治疗肿瘤提供一种新的策略4。生物体内的NO是一种反应极强的效应分子，也是体内发现的第一个气体信使分子。我们的前期研究已证实，用硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）作为外源性的NO供体，可通过细胞阻滞于G0/G1期而显著抑制K562细胞的增殖并诱导K562细胞凋亡。本研究通过观察硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中STAT3、P38MAPK及端粒酶hTERT-mRNA表达的变化，探讨硝普钠对白血病细胞作用的机制。材料和方法实验试剂外源性NO供体硝普钠（SNP）、二甲亚砜、噻唑蓝（MTT）、蛋白酶K、多聚甲醛均为Si

12、gma产品；DNA-Prepkit(内含透膜剂，RNase和PI)为美国Beckman-Coulter公司产品；Annexin-和PI试剂系法国Immunotech公司产品；TUNEL试剂盒购自Calbiochem公司。PE标记的磷酸化P38MAPK（T180/Y182）单克隆抗体（Clone:36）和磷酸化Stat3（Y705）单克隆抗体（Clone:4）购自BD Bioscience公司；hTERT-mRNA实时荧光定量PCR试剂盒由Roche公司提供。细胞培养K562细胞株由浙江大学医学院儿童医院血液病研究室汤永民教授惠赠。采用含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液（Gibco公

13、司产品）并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、青霉素100 U/ml，链霉素100 g/ml的培养体系，在5%的CO2、饱和湿度下37的培养箱中悬浮培养，2-3天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验。K562细胞增殖抑制的MTT测定将对数生长期的K562细胞调整细胞浓度为5104，接种于96孔无菌培养板中，每孔200 l。实验组设4种不同浓度(0.5、1.0、2.0、3.0 mmol/L)的SNP，每组每个浓度下设3个复孔，培养24、48和72小时后加10 l MTT(10 mg/ml)，继续培养4小时后离心弃上清液，每孔加入200 l DMSO终止反应，微振荡后，用全自动酶标仪在570 n

14、m波长处读取吸光度（A）值。计算增殖抑制率，公式为抑制率（%）=（A对照-A实验/A对照-A空白）100%SNP诱导K562细胞凋亡作用的检测Annexin V/PI测定 SNP与K562细胞置于5% CO2的培养箱中在37孵育24小时，轻轻收获细胞1106个，用冷PBS洗1遍后置0水浴中，加490 l结合缓冲液，轻轻地混匀细胞后加入5 l FITC-Annexin V和5 l PI，10分钟后用流式细胞仪检测。细胞DNA亚二倍体测定 取SNP与K562作用的培养细胞悬液0.5 ml，用冷PBS洗涤1次，加DNA-Prepkit中的透膜液50 l，轻摇后放置1分钟，加碘化丙锭染液500 l作用15分钟后，在EPICS-XL型流式细胞仪（Beckman-Coluter产品）上进行分析，用Muticycle 软件进行DNA倍体及细胞周期分析，计算亚二倍体峰 (sub G1)的百分率。TUNEL测定 将SNP与K562培养48小时后的细胞涂片用4%多聚甲醛室温下固定15分钟，再用80%乙醇固定5分钟。用TBS水化15分钟，加细胞透膜液（内含0.1%的Trinton X-100，1 g/L的枸橼酸钠），室温放置5分钟后用甲醇-双氧水除内源性过氧化物酶。加入50 l DNA末端反应液(以不加TdT酶溶液的反应溶液用作实验本底对照)，置37水浴90分钟。用TBS洗涤2次后加碱