无定形磷酸钙负载rhBMP2纳米缓释体的生物相容性及安全性

1、无定形磷酸钙负载rhBMP?2纳米缓释体的生物相容性及安全性    中国 作者：王皓宇,吴小涛,张绍东,沈素祥,李延报,杨惠林,唐天驷 【摘要】 目的观察无定形硫酸钙(ACP)负载重组人骨形态发生蛋白?2(rhBMP?2/ACP)纳米缓释体的生物相容性及安全性,为新型材料的临床应用提供必要的实验依据。方法对材料分别进行体外溶血实验、微核实验、急性毒性实验、热原实验、皮内刺激反应实验和短期肌内埋置实验、骨内植入实验。结果材料浸提液对兔血无溶血现象，对小鼠骨髓细胞无遗传毒性作用，未引起小鼠急性毒性反应、兔热原反应、兔皮内刺激反应；兔短期肌肉埋置、骨内植入后局

2、部无明显炎症反应、无组织坏死，材料逐渐发生降解，能与组织有机融合。结论rhBMP?2/ACP纳米缓释体的生物相容性及安全性符合ISO10993、GB/T16886规定的体内植入物的生物学评价标准，可作为骨修复替代材料用于相关疾病的临床 治疗 。 【关键词】 重组人骨形态发生蛋白； 无定形硫酸钙； 生物相容性 Abstract：ObjectiveTo study the biocompatibility and security of the recombinant human bone morphogenetic protEin?2(rhBMP?2) loaded amorphous calc

3、ium phosphate (ACP) delayed release nano?sized material and investigate the feasibility of the clinical use as a kind of bone substitute in bone engineering.MethodThe in vitro hemolyzation, cytotoxicity, microkernel test in marrow smear, acute systemic toxicity, pyrogenicity, subcuticular stimulatio

4、n reaction and short?term intramuscular implantation, as well as endosseous implantation were performed on the rhBMP?2/ACP delayed release nano?sized material.ResultThe material?extracted liquid induced no hemolyzation, no toxic effects of genetic ,no pyrogenic reaction in rabbits, no cytotoxicity c

5、ultured in rabbit bone marrow?derived mesenchymal stem cells(BMSCs) in vitro and no acute toxicity in mice. The intramuscular implantation and endosseous implantation in rabbits induced no inflammatory reaction, tissue necrosis and the material was degraded gradually, fused organically with tissues.

6、ConclusionThe biocompatibility and security of the rhBMP?2/ACP delayed release nano?sized material could meet the requirements given in biological standards for implanted biomaterials ISO10993 and GB/T16886, suggesting that it could be a good bone substitution for the clinical trial. Key words：rhBMP

7、?2; amorphous calcium phosphate; biocompatibility 在各类创伤造成的骨缺损修复中，植骨材料的选择一直是临床重视的问题。伴着生物材料的飞快 发展 ，具有良好生物活性的支架材料负载肯定量的生物活性因子形成的骨修复替代材料成为近年研发的热点之一。作者采用无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate, ACP）负载重组人骨形态发生蛋白?2（recombinant human bone morphogenetic protEIn?2, rhBMP?2）制备的纳米缓释体兼容了ACP良好的生物活性、细胞黏附性、细胞相容性1和rhBMP?

8、2良好的诱导成骨作用2，能满意支架材料可控的生物降解速率和优异的骨传导性能，缓释体中的rhBMP?2符合双向动力学释放 规律 ，且有良好的缓释效果3。本文在前期实验的基础上，综合评价rhBMP?2/ACP纳米缓释体的生物相容性及安全性。 1 材料与方法 1.1 实验材料试件制备 在ACP原制备技术基础上3,4，模拟 自然 骨组织成分和微结构想象，以湿化学法合成制备rhBMP?2/ACP纳米缓释体实验材料(以下简称实验材料)，并将其预制成直径2 mm，高为6 mm圆柱体标准试件，聚乙烯塑料袋双层密封包装，经60Co 25 kGy辐射灭菌后备用。 1.2 实验材料浸提液制备 取实验材料固相粉末12

9、 g，经60Co 25 kGy辐射灭菌后，浸入盛有120 ml生理盐水的无菌容器中，37静置浸提10 d，取其上清液移入无菌玻璃容器内密封备用。 1.3 溶血实验 常规心脏穿刺抽取新西兰兔血10 ml，即刻加入20 gL草酸钾0.5 ml混合抗凝，取抗凝兔血8 ml加入10 ml生理盐水中稀释备用。实验分为3组，每组各3管,每管加入0.2 ml稀释兔血,再分别于实验材料组加入材料浸提液10 ml,阴性对照组加入生理盐水10 ml,阳性对照组加入双蒸水10 ml。全部试管37水浴1 h,肉眼观察有无溶血, 2 000 rmin离心5 min，取上清液，在分光光度计545 nm处测定吸光度值,各组

10、取均值 计算 溶血度。溶血度（实验材料的吸光度阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度阴性对照吸光度）×100%,溶血度>5 为阳性反应，表示有溶血现象。 1.4 微核实验 取清洁级密封群健康成年昆明小鼠12只，雌雄各半，体质量2025 g，均衡性别后随机分为3组，实验组和阴性对照组分别以0.05 ml/g体质量剂量腹腔注入材料浸提液或生理盐水，阳性对照组以0.04 mg/g体质量剂量腹腔注入环磷酰胺，间隔24 h给药1次共4次，于末次给药后6 h处死实验鼠，常规提取胸骨髓制作涂片，Gimsa染色，每只小鼠观察1 000个嗜多染红细胞中微核细胞数，计算其发生率。 1.5 急性毒性实验

11、 取健康成年昆明小鼠12只，雌雄不限,体质量2025 g，随机分为两组，序列编号。实验组以0.05 ml/g体质量剂量腹腔内一次性注入材料浸提液,对照组同剂量注入生理盐水。记录24、48、72 h小鼠体质量变化，14 d内小鼠的呼吸、进食、运动等一般情况及不良反应或死亡等。 1.6 热原实验 取健康成年新西兰兔6只，雌雄不限，体质量为2.22.4 kg，序列编号。材料浸提液注入前0.5、1 h各测肛温1次,取均值为正常值。将材料浸提液以5 ml/kg体质量剂量自兔耳缘静脉缓慢注入，每间隔1 h测量肛温1次，共3次，记录各兔体温值。体温降低值为3次体温最高值减去正常值。 1.7 皮内刺激反应实验

12、 取健康成年新西兰兔3只，雌雄不限，体质量为2.02.4 kg。于实验前1 d备皮，在兔背部脊柱两侧脱毛。常规消毒后于兔脊柱一侧有序排列的5个点上皮内各注射0.2 ml浸提液，在对侧对应点注射0.2 ml生理盐水。注射后观察并记录即刻、24、48、72 h各时相点各注射部位的红斑和水肿状况。在各时相点将各兔观察点出现的红斑和水肿的原发性刺激记分相加，再除以观察点总数为实验材料原发性刺激记分。将实验材料试点原发性刺激记分减去对照液试点记分得出每只兔原发性刺激记分。以各时相点观察记录数据计算原发性刺激指数。 1.8 肌内埋置实验 取同窝同系健康成年新西兰兔6只，雌雄各半，体质量2.02.4 kg，

13、以3%戊巴比妥钠1 mg/kg股部肌注麻醉，兔背部脊柱两侧依次按上下左右各做长约2 cm小切口4个，分层达筋膜，在肌肉内钝性分离形成肌袋，将无菌材料试件植入肌袋，逐层缝合切口。术后分笼饲养，观察实验兔术后一般情况。于术后1、2、4周分别处死2只实验兔，切取植入区组织块，大体观察有无水肿、化脓、材料排出等,并制作标本切片,HE染色，光镜下观察炎性反应和纤维包膜形成情况。 1.9 骨内植入实验 取同窝同系健康成年新西兰兔6只，雌雄各半，体质量为2.02.4 kg，术前1 d脱毛。3%戊巴比妥钠兔耳缘静脉注射麻醉后，常规切开股骨外侧肌肉，分离暴露股骨中段，用消毒牙钻在股骨骨面上钻孔至髓腔，孔径为2.

14、2 mm，每侧股骨钻孔2个，将无菌实验材料试件植入孔内，凝固后骨蜡止血，封闭试件与孔之间的缝隙。逐层缝合切口，放回笼内单独饲养，观察实验兔术后一般情况。于术后2、4、12周各处死2只，取出股骨全段，系列脱钙制作标本切片, HE染色，光镜下观察成骨和材料降解情况。 1.10 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件处理，数据用均数+标准差(±s)表示，单因素方差分析,P<0.05有统计学意义。 2 结果 2.1 溶血实验 实验材料对健康兔血的溶血度平均值为1.59% (表1)，低于标准规定的5%，可认定实验材料无体外溶血作用。 表1组别试管1试管2试管3平均值溶血度 2.2 微核实验 各组小鼠胸骨髓涂片中出现微核的嗜多染红细胞的发生率分别为，实验组雌性鼠0.02%、雄性鼠0.03%，阴性对照组雌性鼠0.03%、雄性鼠0.04%，阳性对照组雌性鼠2.16%、雄性鼠2.22%；实验组微核率与阴性对照组比较差异无统计学意义（