试论自体移植法子宫内膜异位症模型大鼠妊娠功能的研究

1、试论自体移植法子宫内膜异位症模型大鼠妊娠功能的研究         【关键词】  子宫内膜异位症/免疫学； 摘要：【目的】观察自体移植法子宫内膜异位症模型大鼠的妊娠功能，以评价该模型是否能代表人类子宫内膜异位症不孕的病理状态。【方法】取大鼠子宫内膜自体移植复制子宫内膜异位症动物模型，观察模型大鼠的内分泌与免疫功能状态；继而使之与雄性大鼠同笼研究其生殖功能，并与正常大鼠比较。【结果】在免疫功能方面，子宫内膜异位症模型大鼠血中肿瘤坏死因子(TNF)含量升高(与假手术组比较，001)；在生殖内分泌方面，动情前期

2、模型大鼠血中促黄体生成素(LH)水平降低、催乳素(PRL)水平升高，动情后期的血中孕激素(P)水平降低(与假手术组比，均001)；且模型大鼠的排卵数、活胎数、着床率等均低于正常大鼠(与假手术组比，005或001)。【结论】自体移植法子宫内膜异位症模型大鼠出现生殖功能低下，可作为子宫内膜异位症不孕的模型动物；该模型模拟子宫内膜异位症患者的不孕，可用来进行助孕实验研究及助孕药物研究。 关键词：子宫内膜异位症/免疫学；妊娠；疾病模型，动物；不育，女(雌)性/免疫学 子宫内膜异位症(EMT)是指有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔面以外的部位而引起的病症，是一种病因不明、多种病理状态、多种临床表现并存

3、的复杂疾病。为攻克这一疑难疾病，人们设计了在体动物实验模型以及单种细胞培养、多种细胞共培养、组织共培养等离体实验模型进行研究。但这些模型各有利弊，均不能完全模拟子宫内膜异位症发生、发展的病理过程，特别是不能完全代表子宫内膜异位症患者腹腔微环境的免疫学、神经内分泌学变化。因此，研究者在根据不同的实验目的来选择模型的同时，仍在不断探索及争议这些造模方法。选用大鼠等实验动物以子宫内膜自体移植法复制子宫内膜异位症模型，由于其模拟了异位病灶侵袭生长的特点，已用于药物抑制病灶生长的研究，但鉴于这一疾病的特殊性、复杂性，单纯病灶的生长与抑制并不能完全说明疾病的发展与痊愈。子宫内膜异位症患者中不孕的发生率可高

4、达80%，其发生机理尤其复杂，以离体的模型进行不孕症的研究，显然不具备说服力，而以自体移植法复制在体动物模型是否可代表患者的不孕状态进行助孕药物研究，尚无人观察。本实验试图研究子宫内膜异位症模型大鼠是否可体现子宫内膜异位症患者所表现的妊娠功能障碍状态，以评价该模型是否可用于子宫内膜异位症不孕的实验研究及助孕药物的研究。 1  材料与方法 11  实验动物        普通级SD大鼠27只，雌性，性成熟，未经交配生育，体重180220g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：2000A019；普通级

5、SD大鼠15只，雄性，健康性成熟，体重250300g，中山医科大学实验动物中心提供，合格证号2000A005。 12 检测药盒与仪器        促黄体生成素(LH)放免检测药盒、孕激素(P)放免检测药盒、催乳素(PRL)放免检测药盒均由北京北方生物技术所提供；肿瘤坏死因子(TNF)试剂盒由解放军总医院科技开发中心提供；BECKMAN BP5500型记数仪。 13 造模方法        选用健康性成熟、未经交配的雌性SD大鼠，每日进行阴道细胞涂片检查，

6、选择动情周期45d者为合格动物，在第3个动情周期的动情期进行手术造模，随机取其中13只行假手术作为对照组，其余均复制子宫内膜异位症模型。 131 子宫内膜异位症动物模型造模方法        手术在无菌条件下，以戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔注射(ip)麻醉，然后固定大鼠四肢，剖腹，切口长约15cm，切取右侧宫角处的一段子宫，长约1cm，迅速将其置于生理盐水中，将子宫内膜与肌层分离，并剪取两块各约5mm×5mm的内膜组织块，上皮层反向对着体壁，将组织块四角缝固在腹壁上，左右各一。右侧宫角断端吻合结扎。关腹前予以庆大

7、霉素生理盐水溶液冲洗腹腔，最后缝合各层组织，普通级环境饲养。4周后随机抽取造模大鼠4只，再次剖腹观察移植物生长状况，手术成功的标志为：移植物体积增大，出现液体积聚，被结缔组织或大网膜覆盖并有血管形成。同时切取移植物送检，证实移植物中有子宫内膜上皮细胞、腺体及间质的生长，并有分泌活动。 132 假手术组造模方法        手术条件及麻醉、开腹方法均同EMT模型组，开腹后将右侧子宫角结扎，目的使假手术组与EMT组相同，达到均为单侧宫角子宫的生殖环境。同样以庆大霉素生理盐水冲洗腹腔，逐层缝合各层组织。 14 检测指标及方法&#

8、160;       于动情前期眼球后静脉取血，放射免疫法检测大鼠LH、PRL含量；于动情后期眼球后静脉取血，放射免疫法检测大鼠TNF、P含量；取普通级健康性成熟雄性SD大鼠15只，采血后动物择动情前期以雌雄比例21饲养，每天清晨800后雌鼠阴道细胞涂片，以发现精子当日定为“孕鼠”，并定为妊娠第1天，分笼饲养，未发现精子者继续与雄鼠同笼饲养，“孕鼠”于怀孕第16天处死，剖腹验证是否受孕，摘取左卵巢，计数妊娠黄体数(排卵数)，计算着床率(着床率着床数/排卵数)、活胎数。 15  统计方法   &#

9、160;    全部数据采用EXCEL分析统计，统计方法为t检验。 2 实验结果 21 EMT大鼠动情前期血中促黄体素、催乳素的含量变化        结果见表1。表1 EMT模型大鼠动情前期血中LH、PRL含量的变化（略） 22  EMT模型大鼠动情后期血中P、TNF的水平变化                  结果见表2。表2 EMT

10、模型大鼠动情后期血中P、TNF的水平变化（略） 23  EMT大鼠妊娠功能的改变情况        结果见表3、表4。表3 两组实验大鼠受孕情况（略）表4  两组实验大鼠排卵、活胎、着床情况比较（略） 表3说明，假手术组大鼠交配后全部受孕，受孕率100%；10只交配后的EMT模型组动物有8只受孕，受孕率80%。2只未孕者均未见妊娠黄体，亦未见子宫角内死胎，说明空孕即完全不孕率为20%，但鉴于大鼠多胎妊娠的特点，单纯受孕率不能全面说明妊娠功能，还应观察大鼠的排卵、活胎、着床情况(见表4)。EMT模型组的妊娠

11、鼠中有2只为死胎，而假手术组未见死胎。 3  讨论 针对子宫内膜异位症的不孕进行研究，显然在体动物模型生殖功能的变化较离体模型微观理化指标的变化更具说服力。但除人以外只有非人灵长类有周期性的月经，也只有非人灵长类在解剖与生理方面与人类最相近，用这类动物进行子宫内膜异位症不孕的相关研究无疑是最理想的。限于经济及动物保护的原因，灵长类动物模型的使用受到限制，因此，本研究选择大鼠为实验动物，观察自体移植法大鼠子宫内膜异位症模型的妊娠功能是否与人类子宫内膜异位症妊娠功能具有相似性，以便将该模型推广应用于子宫内膜异位症不孕的实验研究与助孕药物研究。 生殖功能实验结果显示，自体移植法复制大鼠子宫

12、内膜异位症模型后出现20%的空孕鼠，即20%为完全不孕，而受试假手术组大鼠受孕率达100%。但鉴于大鼠多胎妊娠的特点，空孕即完全不孕的发生率尚不能完全说明大鼠妊娠功能的高低，因此，我们对受试大鼠的排卵数目、活胎数目、着床率以及死胎情况进行观察。结果表明子宫内膜异位症模型组受孕大鼠排卵数、活胎数、着床率均较假手术组明显降低，并出现死胎。说明自体移植法大鼠子宫内膜异位症模型妊娠功能出现障碍，与人类子宫内膜异位症患者出现的不孕症有一致性。而研究发现人类子宫内膜异位症患者不孕的发生也是一个复杂的病理过程，涉及到免疫功能的紊乱、生殖内分泌的紊乱等多方面的因素。因此，我们对子宫内膜异位症模型大鼠的免疫功能

13、及生殖内分泌功能进行观察。 31  免疫功能的失调        子宫内膜异位症患者存在着复杂的免疫功能失调。免疫失调通过影响内分泌、抑制排卵、阻碍精卵结合及受精卵着床、早期胚胎毒性等机理影响受孕；腹腔液TNF含量升高亦是其中一个因素，TNF对精子运动有抑制作用，从而阻碍精、卵结合。本研究结果显示，EMT模型组大鼠外周血TNF含量明显升高，与EMT患者免疫功能失调而表现出高TNF状态一致。本实验中10只交配成功的模型组大鼠中有2只为空孕，且另外8只妊娠大鼠育胎仔数目较少，着床率低，与模型大鼠的TNF含量升高有关。其

14、他多种免疫因子对精子的吞噬、对早期胚胎的免疫攻击是否也是导致EMT模型大鼠妊娠功能低下的原因，有待进一步研究。 32 内分泌功能的紊乱        子宫内膜异位症模型大鼠生殖内分泌检测发现，模型大鼠动情前期LH低于假手术组、PRL高于假手术组，动情后期P低于假手术组，与子宫内膜异位症患者所表现的排卵功能障碍、黄体功能不全、高催乳素血症相符。因此，在生殖内分泌紊乱状态下，模型大鼠排卵功能障碍，排卵数目明显少于假手术组，动情后期P水平低于假手术对照组，表明模型大鼠黄体功能不足，故10只交配成功的模型大鼠中有2只发生空孕、8只妊

15、娠大鼠排卵数目少、孕育胎仔数目少、着床率低，均与该组大鼠紊乱的内分泌所造成的排卵功能障碍与胚胎种植、发育条件不足有密切关系。 以上研究说明，用自体移植法复制大鼠子宫内膜异位症模型，其妊娠功能较正常大鼠明显低下，且在内分泌、免疫功能方面均达到与子宫内膜异位症患者相似的病理状态。因而，我们认为该模型在生殖功能方面与人类子宫内膜异位症患者具有一定相似性，可模拟子宫内膜异位症不孕患者作为子宫内膜异位症不孕的实验动物模型使用。 参考文献： 俞超芹，翟美芙，刑玲玲，等内异方对SD大鼠子宫内膜异位症模型种植内膜作用的实验研究中国实验方剂学杂志，1996，2(4)：34 Piva M,Horowitz G M

16、,SharpeTimms K L.Interleukin6 differentially stimulates haptoglobin production by peritoneal and endometriotic cells in vitro:a model for endometrialperitoneal interaction in endometriosisClin Endocrinol Metab,2001,86(6):2553. Zhang R J,Wild R A,Ojago J M.Effect of tumor necrosis factoralpha on adhesion of human endometrial stromal cells to peritoneal mesothelial cells:an in vitro systemFertil & Steril,1993,59(6):1196. Carig A