树突状细胞介导的主动性免疫治疗

1、树突状细胞介导的主动性免疫治疗树突状细胞（Dendritic cell, DC） 是一类具有典型树突状形态、膜表面高表达MHC-II类分子、具有相对特异性表面标志，并能移行至淋巴器官和刺激初始T细胞进行活化增殖的一类免疫活性细胞。DC 最早由Steinman和Cohn等发现，是体内抗原递呈功能最强的专职抗原递呈细胞。由于DC在免疫应答是启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。因此利用DC在患者体内诱导肿瘤特异性的、持久的免疫应答，是目前将DC-肿瘤疫苗用于治疗恶性肿瘤的基础。利用采用负载靶抗原的DC治疗性疫苗已经在肿瘤和感染性疾病的治疗研究中取得了令人瞩目的进展，如治疗激素耐受的前列腺癌已经进入

2、III期临床研究，我国第一项DC疫苗治疗转移性大肠癌的研究也已经进入II期临床研究。 一、DC的生物学特性研究发现人类DC起源于骨髓造血祖细胞、分属两个不同的亚群即髓样DC(myeloid DC，MDC)和淋巴样DC(1ymphoid DC,LDC)，分别起源于CD34的髓系造血干细胞和淋巴系造血干细胞。髓样DC在体内分布非常广泛，在淋巴组织和非淋巴组织中，MDC可分为在多种生长因子的作用下人类骨髓和脐带血中的CD34的髓系前体细胞及外周血中CDI4单核细胞分化成DC1，而胸腺、脾脏和外周血中的T细胞前体细胞及扁桃体中的浆细胞样细胞分化成DC2。人类DC1表达CDIa、CDIlb和CDIlc，

3、DC2不表达CDIa、CDIlb和CDIlc，鼠DC1不表达CD8a、而表达CDIlb、CDIlc、不或低表达DEC-205，鼠DC2表现为CD8a、CDI lb低表达和DEC一205高表达。DC具有其他免疫细胞所没有的形态特点和运动能力，分布广泛，DC有两个不同的功能亚群，分别称为DC1和DC2。不成熟DC在外周组织摄取、处理人侵的抗原后，经过成熟和迁移途径到达二级淋巴组织，致敏(priming)初始Th细胞，在此，DC把不同类型抗原信号传递给初始 Th 细胞，使后者定向分化为Thl或Th2细胞亚群，其中DC1诱导Thl分化，DC2诱导Th2分化。人DC1/DC2亚群人DCI和DC2亚群的概

4、念最早由DNA研究所的Rissoan于1999年提出，他们在体外用不同细胞因子组合培养诱导出两种不同功能的人DC亚群。人DC1亚群人外周血单核细胞 DC 前体（pDC1）加 GM-CSF 和 IL-4 培养后分化为不成熟髓样 DC，再用CD40L或LPS刺激后变为成熟髓样DC，这种DC亚群表达高水平 GM-CSF 受体和低水平 IL-3 受体，分泌大量IL-12，诱导人Thl 应答，因此称为人 DCI 亚群。除 IL-12 以外，人DCI亚群还分泌 IL-la、IL-l b、IL-6、IL-8和IL-10,但不分泌lL-4。分离人外周血或扁桃腺中浆细胞样DC前体细胞（pDC2），加人IL-3培

5、养，再用CD40L刺激，pDC2即分化为成熟淋巴样DC，它表达高水平IL-3Ra和低水平GM-CSF受体，仅分泌低水平IL-12，可诱导人Tll2应答，故命名为人DC2亚群。与人Th2亚群不同的是，人DC2亚群不分泌IL-4，而且体外加人IL-4还对pDCZ有杀伤作用。显然，人DC2亚群利用了IL-4以外的信号转导途径使初始 Th 细胞向 TllZ 亚群分化。体外用单抗交联人DC2细胞上的CD40分子，还可刺激其分泌 IL-8。人pDC2和DC2亚群具有明显的淋巴细胞谱系特征：几乎不表达髓样抗原，如CDllb、CDllc、CD13和CD33；体外加人GM-CsF和M-CSF培养，不能分化为巨噬

6、细胞； 吞噬、巨胞饮抗原的能力始终很弱；存活和成熟依赖 IL-3，不依赖GM-CSF；高表达前T细胞受体a链（pTCRa）。20世纪80年代早期，曾报道在外周血中发现一种分泌大量IFN-的细胞，起名为天然干扰素产生细胞（natural interferon producing cell,IPC）。现有证据表明，IPC表达CD4和MHC-II类分子，可能就是pDC2。受到HSV刺激时，分离纯化的pDC2比外周血全白细胞分泌的 IFN-。含量高1000倍。二、DC 对抗原的摄取、加工递呈（一）DC 摄取外源性抗原的机制 对于大多数细菌、真菌及胞外寄生虫等外源性抗原，不成熟 DC 可通过吞噬、微胞饮

7、、巨胞饮或借助于细胞表面的模式识别受体（PRR），如SR、MR、DEC-205、CR和 FcR等将抗原摄入胞内。 1. 吞噬作用 吞噬作用（phagocytosis）是指细胞摄取直径大于 0.5 m 的颗粒性物质和微生物的一种方式。 2. 吞饮作用吞饮作用（pinocytosis）是DC 摄取胞外少量液体的方式。m。体内几乎所有细胞均存在微胞饮现象。(2)巨胞饮（macropinocytosis）: 所谓巨胞饮是相对于微胞饮而言，巨胞饮更像吞噬运动，它形成的巨胞饮泡直径可达 13 m ，可承载大量外源性液体和溶质。体内只有巨噬细胞和 DC 具有巨胞饮能力，其中 DC 的巨胞饮能力比巨噬细胞更强

8、。(3)受体介导的内吞巨噬细胞表面受体: DC也表达多种类似PRR，如DEC-205、FcgR和FceR。这些受体均可介导抗原内吞。其中C型凝集素家族DEC-205和低亲和力FcgIIR所起作用最大，DC在体外对甘露糖化的蛋白质分子的呈递作用比非糖基化的高100倍。MR和DEC-205主要结合甘露糖化和岩藻糖化的抗原分子 ，巨噬细胞和DC将MR-抗原复合物一同内化入细胞内体中，内体和溶酶体进一步融合成内体溶酶体，MR-抗原复合物在内体溶酶体的酸性环境中解离，释放出抗原分子；而 Fcg R 结合的抗原-抗体复合物则是在内化后一起降解。（二）DC 加工处理抗原的机制 对于大多数病毒、胞内寄生菌和胞

9、内寄生虫等内源性抗原（endogenous antigen），DC 可被其直接感染，这些病原体从而在DC 胞浆内合成病原体蛋白分子，即所谓的内源性抗原。然后DC 通过胞质溶胶途径将病原体抗原切割为 810 个氨基酸的肽段，在 TAP1 / TAP2的转运下进入内质网，加载到 MHC - I 类分子的肽结合沟槽内， MHC -I 抗原肽段复合物再经分泌途径表达在DC 表面。2. 外源性抗原的呈递外源性抗原被巨噬细胞或 DC 摄取后在内体溶酶体中被组织蛋白酶切割成 14 - 20 个氨基酸的短肽，与 MHC -II 类分子组装成 MHC-II/抗原肽段复合物，经高尔基体分泌途径表达在巨噬细胞和 D

10、C 表面。3.DC 对外源性抗原的交叉递呈 一般情况下，内源性抗原通过MHC-I类分子递呈，外源性抗原通过MHC-II途径呈递。但在体内此规律并不是绝对的，有些情况下，MHC-I类分子也可以呈递外源性抗原, DC 和巨噬细胞都能通过胞质溶胶途径呈递外源性抗原，其中 DC 的这种能力更强。对于肿瘤抗原和移植物抗原， DC 能通过胞质溶胶途径进行呈递，诱导 CD8的CTL应答。此外，巨噬细胞还能利用其表面的 MR 摄入病原体糖脂类抗原，加工处理后与非经典 MHC-I类分子CDlb结合。近年来进行的研究使人们初步对这种现象的机制有了一定的认识。 (1)交叉致敏和交叉呈递交叉致敏（cross prim

11、ing）：这个概念最早由 Bevan 在加世纪 70 年代进行同类系小鼠组织移植时提出。同类系小鼠的MHC抗原完全相同，但次要组织相容性抗原（minor histocomPatibihty antigen,mHA）不同，结果也能发生移植排斥反应，Betran发现受者APC可以呈递供者细胞表面的 mHA ，活化致敏受者 CTL。近年研究发现，体内 MHC-I类分子也可以组成性呈递外源性自身肽段，人们把这种现象称为交叉呈递（ cross presentation ）。(2) MHC-I类分子呈递外源性杭原的机制：MHC-I 类分子呈递外源性抗原至少存在两种不同的机制。一种是 TAP 依赖方式的，A

12、PC摄入的外源性抗原可从内体中逃逸出来，进人细胞溶胶，然后被细胞溶胶中的蛋白酶体切割为肽段，再经 TAP1/TAP2的转运进入内质网，加载到 MHC-I类分子肤结合沟槽内，HSP也可以将抗原肤段送入内质网。此方式和经典的内源性抗原呈递机制非常相似。另一种方式则是 TAP非依赖的，抗原不需要细胞溶胶中蛋白酶体的切割以及 TAP 的转运，而依然是在内体溶酶体中被组织蛋白酶水解。然而切割后形成的抗原肽段是如何加载到 MHC-I 类分子上的还不清楚，目前认为可能有下列三种途径：内体溶酶体中产生的抗原肽段经某种机制转运到胞外，直接和胞膜上的MHC-I类分子结合；胞膜上的 MHC-I类分子内化进入内体溶酶

13、体与抗原肽段结合；部分在内质网中合成的 MHC-I 类分子可与恒定链（ Ii ）结合，在Ii链的引导下进人内体溶酶体与抗原肽段结合。体外实验显示，在高剂量可溶性抗原存在下， APC可以通过 MHC-I 类分子呈递抗原。将外源性可溶性抗原包被到颗粒物质或载体细胞表面或直接利用电穿孔方法将性抗原导人细胞内，可以使外源性抗原进入细胞溶胶途径。三、DC诱导的免疫应答尽管DC在外周血中所占极微，但它们大部分分布于机体的门户部位，如皮肤、黏膜，组成机体的哨兵部队。危险信号，如应激反应和炎症因子（TNFa、IL-1b、MIP-3a），能够加速血中的DC前体向外周迁移。外周组织的DC处于未成熟状态，具有较强的

14、吞饮、吞噬能力以获取抗原。DC获取抗原通过4种方式：吞噬方式获取颗粒性抗原；通过巨吞饮作用或受体介导的内吞作用（甘露糖受体、Fcg、DEC-205受体）获取可溶性抗原；直接获取凋亡细胞或病毒感染细胞表面的抗原性物质，又称交叉致敏。获取的抗原性物质在DC细胞内被降解为小分子片段，然后在胞内一系列分子的帮助下，装载到MHC-或MHC-分子上，运送到细胞表面，等待呈递给T细胞。而捕获抗原后的DC，一方面在胞内进行抗原的加工，另一方面将进行从外周-输入淋巴管-淋巴组织的T细胞区域的迁移过程，并且在这个迁移过程中DC逐渐成熟。进入淋巴结T细胞区域的DC能与初始型T细胞形成稳定的聚集体并激活T细胞，这有赖

15、于DC和T细胞表面表达互为配受体的黏附分子。而DC表面的MHC-抗原肽复合体与T细胞的TCR-CD3的相互作用，向T细胞传递抗原信号，启动后续DC与T细胞之间的共刺激分子之间的相互作用，如DC表面的CD40分子与T细胞表面的CD40L结合，促进DC表达共刺激分子CD80/CD86，后者与T细胞表面的CD28/CTLA-4结合构成T细胞活化必不可少的共刺激信号；此外，在这个过程中DC分泌IL-12，T细胞分泌IL-2、IFN-g等，通过旁分泌或自分泌方式，与上述双信号共同诱导初始T细胞的活化， DC在发挥功能的同时也获得了最终成熟。在DC与T细胞相互作用的过程中，分泌多种细胞因子、趋化因子，除了

16、促进各自的增殖活化，还可以趋化其它免疫细胞，共同参与免疫应答，对免疫应答起到放大作用。DC可以诱导不同类型的T细胞介导的不同的免疫应答，这与DC的亚群及它们接受的抗原刺激以及免疫途径有关。肿瘤、病毒、同种抗原主要诱发机体产生Th1型细胞介导的免疫反应，由DC1启动。DC1产生IL-12诱导Th1分化、分泌IL-2和IFN-g，并活化CD8CTL和CD4CTL为特征。此外，CD8CTL可以不经过辅助性T细胞的帮助直接接受DC呈递的抗原而活化（cross-priming）。因此，Th1细胞介导的免疫反应能够保护机体免受病毒、肿瘤的侵犯。相反，Th2细胞介导的免疫反应通过Th2分泌IL-10、IL-

17、4抑制DC对Th1细胞的诱导分化作用，从而对Th1细胞介导的抗肿瘤抗病毒免疫应答有下调作用。目前发现，肿瘤组织微环境中存在大量的IL-10，抑制DC诱导Th1细胞分化的作用，导致机体对肿瘤组织的耐受状态。成熟活化的DC除了与初始型T细胞相互作用诱导抗原特异性CTL外，还可以通过直接或间接方式影响B细胞的增殖，活化体液免疫应答；与记忆T细胞相互作用诱发再次免疫应答；与NK作用促进机体建立非特异性的、天然免疫应答。四、肿瘤抗原致敏的树突状细胞在临床中的应用策略可以预防和治疗癌症的疫苗DC，有望成为有效消灭肿瘤患者体内残存肿瘤细胞，成为预防术后复发的新手段。这是柳叶刀中文版、世界核心医学期刊等杂志特

18、约编辑，北京武警总队第二医院生物诊疗中心王顺涛教授，在10月21日至23日召开的肿瘤基础与治疗国际研讨会上透露的。王顺涛主任提出，树突状细胞（ DC）是来源于患者外周血和骨髓专职的功能最强的抗原递呈细胞，它通过捕捉、加工处理各种细菌、病毒以及肿瘤抗原，在树突状细胞表面生成大量能激发免疫反应的肽复合物，并在多种协同刺激分子和大量免疫调节性细胞因子的辅助下，激活 T细胞，诱导出高效杀伤肿瘤的免疫反应。他说，该研究选择了25例消化道肿瘤患者，进行该项治疗的体外研究，结果表明，该特异性杀伤细胞对特异性肿瘤细胞的杀伤力比非特异性杀伤力提高2035。肽疫苗治疗肿瘤在打破患者免疫抑制，重新启动自体免疫力的作用上高于以往的免疫治疗