Transwell试验方法

1、Transwell 试验方法Transwell 细胞侵袭实验与移动实验一、试剂和耗材1)细胞及细胞培养基：KYSE150细胞、含10%FBS的RPMI1640培养基及无血清 RPMI1640培养基。0ZDYK2)10>PBS(PH7.0):2.87gNa2HP04 1220( MW 358.4 )KH2P04(MW 136.09)0.2gNaCl(MW 58.44 )8.0g0.2gKCl( MW 74.55)去离子水至 100 ml高压灭菌后，室温保存。使用液为1XPBS（用无菌水进行1: 9稀释）。3)冰乙酸 :甲醛（ 1:3）4)Transwell 小室 (BD, Bioscien

2、ce)5)Matrigel 基质胶( BD, Bioscience，50ug/ml) ：商品化，保存 -20°。6)各种规格的枪头、1.5ml离心管及10ml玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml 的离心管于 -20oC 预冷，备用。 cfXiB 。7)5810R台式高速冷冻离心机（Eppendorf）, TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad ）8)细胞计数板、 6 孔板二、实验步骤一）侵袭实验1. 润化： 在无菌台上取出 Transwell 小室，置于 24 孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化 5-15min。AtZ4M2.细胞准备：

3、在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入 5ml无血清培养基，常规培Transwell 试验方法养 24h。 BrZgM。3.细胞的接种：1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37C培养箱中消化，消化时间不宜过长,室膜是否出现裂痕，若出现较多裂痕可停止使用。ffNOW。控制在 1min 以内。 lOMSl。2)加入4C预冷的无血清培养基（建议 6孔板2ml，培养瓶5ml ），轻轻吹打均匀后，收集至 10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4C、700rpm/min，离心5min ； OuqxN。3)弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；4)弃除上清，加入适

4、量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细胞密度大于1.5 >105/ml）,轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取 10ul 用于 Bio-Rad TC10 活细胞计数； 5KgJP。5)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25 >05/ml;6)4.细胞染色及拍照：1)弃孔内培养基，将小室取出，弃去孔中培养基，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，此过程要求快速完成， 避免让小室的膜过于干燥， 将小室置于已加入 500ul 固定液的培养孔

5、中， 在上室中加入 200ul固定液，固定 5-10分钟左右。此过程要将保证培养板盖有盖子，以防挥发。Zyyyo。2)弃去孔中固定液，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，将小室置于已加入 500ul苏木素染液的培养孔中，上室中加入 200ul固定液，染色10-15min。Gkvmd3)将小室转移至新的培养孔中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面的细胞。4)往小室内加入100ul PBS,倒置显微镜观察穿过去的细胞，200X光镜下计数10个视野的侵袭细胞数，取其平均值 ,以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。yEbcP。5)若颜色偏浅，可以置于染色液中重复染色，水洗至适当

6、颜色后即可。二）移动实验1. 小室润化： 在无菌台上取出 Transwell 小室，置于 24 孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化 5-15min，备用。Gthh3。将接种好的细胞放入培养箱，37C、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。Tran swell试验方法2.细胞准备：常规培养细胞，用 PBS （已灭菌）或无血清培养基洗涤 3次后，加入常规量无血清培养基饥饿 12h。Dch6l。3.接种Transwell小室1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37C培养箱中消化，消化时间不宜过长,控制在1分钟以内。ozSCs2)加入4C预

7、冷的无血清培养基（建议 6孔板2ml，培养瓶5ml ），轻轻吹打均匀后，收集至 10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4 C、700rpm/min，离心五 min ； sjy4W。3)弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释细胞密度大于1.5 X105/ml），轻轻吹打均匀后，取 10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；OLjNw4)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25 X05/ml;5)将一定数量Tr

8、answell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液 4001逐滴加入小室；取 500 gl含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中,并保证小室膜与培养液之间无气泡。FoyW丁6)将接种好的细胞放入培养箱，37C、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。4.细胞染色（Giemsa试剂盒）及拍照:（三）Transwell小室重复利用处理方法拍照结束后，将小室直接放入6孔板/24孔板中，小室上下均加入适量胰酶，使膜浸泡在胰酶中，室温放置过夜（约6h以上）；9zvlb。2.3.将小室取出，用75%乙醇浸泡5min （可将小室全部没入乙醇中），重复三次，以除去苏木素染色;无菌水漂洗几次以除去