虫草液体发酵培养基的优化研究

1、福建武夷山第九届全国药用真菌学术会议暨药用真菌专业组织成立三十周年庆年月虫草液体发酵培养基的优化研究毛永强（辽宁工程技术大学理学院，辽宁阜新）摘要：采用摇瓶培养的方法，以菌丝体干重为指标，通过单因素和正交试验对虫草液体发酵培养基组成进行研究。结果表明，虫草液体最优发酵培养基组成为：葡萄糖。蛋白胨，在该条件下菌丝体干重平均可达。关键词：虫草；液体发酵；培养基；菌丝体干重虫草是虫茼复合体，含有虫草素、虫草酸、虫草多糖等多种生物活性物质，具有降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、提高机体免疫力等药理活性。由于生长环境遭到破坏以及人为滥采，天然虫草资源日益匮乏。大量研究表明，人工液体发酵获得的虫革菌丝体和天然

2、虫草的成分基本致，可代替天然虫草入药副。为满足人们对虫草的需求，本试验通过对虫草液体发酵培养基组成进行研究，从而为进一步开发利用虫草提供理论依据。实验材料虫革菌株：本实验室保存的菌株。实验仪器与设备：高速冷冻离心机：电子分析天平；精密计；型分光光度计；高压蒸汽灭菌锅；超净工作台；全温振荡培养箱；电热鼓风干燥箱。实验方法培养基的配制种子培养基：土豆，葡萄糖，。，水。发酵培养基：葡萄糖，蛋白胨，。，水。将上述培养基配制分装后，于，灭菌得。菌种活化和培养虫草新鲜芮丝块接种于种子培养基中，、振荡培养，作为种子液，按接种量接种于发酵培养基，、振荡培养。菌丝体干重测定将发酵液以离，去除卜清液，用蒸馏水反复

3、洗涤菌丝体次，将洗后菌丝体放入已烘干称重的培养皿中，置烘箱中烘干至恒重，用电子分析天平称重。发酵培养基的优化碳源试验以发酵培养基去除葡萄糖为基础培养基，分别加入等量碳源，比较葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及食用白糖等碳源对虫草菌丝体生长的影响。碳源种类试验确定为葡萄糖最佳碳源后，分别加入不同浓度的葡萄糖（、），比较其对虫草菌丝体生长的影响。氮源试验碳源种类确定为葡萄糖后，再以发酵培养基去除蛋白胨为基础培养基，分别加入等量氮源，比较蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、尿素等氮源对虫草菌丝体生长的影响。氮源利一类试验确定蛋白胨为最佳氮源后，分别加入不同浓度的蛋白胨（、），比较其对虫草菌丝体生长的影响。无机盐试验无机盐。

4、及对虫草发酵具有重要影响，因此分别加入不同浓度的（、）和不同浓度的（、），比较二者对虫草菌丝体生长的影响。发酵培养基的正交试验为考察培养基中碳源、氮源和无机盐等各成分对虫草菌丝体生长的影响，设计因素水平的正交表。（），各因素和水平如表所示。表正交试验因素与水平表作者简介：毛永强（）：男，辽宁昌圈人，讲师，硕士，主要从事食药用真萌学的教学和科研工作联系方式：邮编：。地址：辽宁工程技术大学理学院生物系：。联系电话：福建武夷山第九届全国药用真菌学术会议暨药用真菌专业组织成立三十周年庆年月由表和表可以看出，在虫草菌丝体的生长过程中，不同碳源对菌丝体干重影响较大，其中以葡萄糖为碳源时菌丝体干重最大，因此

5、确定葡萄糖为最佳碳源。同时，随着葡萄糖浓度增加，菌丝体干重逐渐增加，但葡萄糖浓度在以后，菌丝体干重逐渐降低。因此，葡萄糖的最佳浓度选择，此时菌丝体干重最大。氮源试验表不同氮源对虫草菌丝体干重的影响由表和表可以看出，在虫草菌丝体的生长过程中，不同氮源对菌丝体干重影响较大，其中以蛋白胨为氮源时菌丝体干重最大，因此确定蛋白胨为最佳碳源。同时，随着蛋白胨浓度增加，菌丝体干重逐渐增加，但蛋白胨浓度在以后，菌丝体干重逐渐降低。因此，蛋白胨浓度选择，此时菌丝体干重最大。无机盐试验表不同浓度对虫草蔺丝体干重的影响由表和袭可以看出，在虫草菌丝体的生长过程中，无机盐浓度对菌丝体干重影响较大。随着无机盐浓度的增加，

6、菌丝体干重逐渐增加，但无机盐浓度达到一定后，菌丝体于重逐渐降低。因此，：。浓度选择为宜，而浓度选择为宜。发酵培养基的正交试验表正交试验结果置之毛；置是加耵眈饽趵；伯临虬硌凹从表中可以看出，各因素不同水平问的组合对茼丝体干重的影响较大。由极差值得知，四个因素对对菌丝体干重的影响大小依次为：，即葡萄糖浓度影响最大，其次为蛋白胨浓度￥。浓度，浓度影响最小。因此，虫草液体发酵培养基最优配方为。，即葡萄糖，蛋白胨，。在此条件下进行次验证试验，菌丝体十重平均可达。福建武夷山第九届全国药用真菌学术会议暨药用真菌专业组织成立三十周年庆年月结论通过对虫草液体发酵培养基进行研究，确定最优培养基组成为：葡萄糖，蛋白

7、胨，在此条件下菌丝体干重平均可达，这将为虫草工业化生产提供理论依据。参考文献张平，虫草属真菌研究进展。生物学杂志。，（）：傅岚陈作红虫草属化学成分及药理作用研究进展生命科学研究，（）：肖建辉，梁宗琦，刘爱英虫草无性型及其相关真菌的研究开发现状药学学报，（）：粱宗琦我国虫草属真蓠的研究开发的现状与思考。食用蔚学报，（）：陆龙喜，刘淑梅，时连根冬虫夏草的研究新进展生物学通报，（）；虫草液体发酵培养基的优化研究作者：作者单位：毛永强辽宁工程技术大学理学院,辽宁 阜新 123000相似文献(10条)1.会议论文 刘炜 冬虫夏草的液体发酵虫草菌丝体 2003本文报道了采用深层液体发酵方法来获得高产优质的

8、虫草菌丝体的研究进展.筛选到了符合工业化生产的发酵培养基,确立了成熟的发酵工艺,并论述了冬虫夏草的药理作用.采用液体发酵法培养虫草真菌菌丝体.以虫草真菌胞内多糖量为指标,通过单因素试验,表明玉米淀粉为最佳碳源,酵母粉为最佳氮源,酵母膏为最佳生物素,最适pH为7.0;正交试验表明最适虫草真菌产胞内多糖培养基配方为:玉米淀粉5%,酵母粉2%,酵母膏0.1%,KH2 PO4 0.1%,MgSO4 7H2 O 0.05%,pH7.0.通过单因子试验和正交试验确定了以蔗糖3%、蛋白胨1%、KH2PO4 0.1%为主的发酵培养基,在培养条件为25,转速150r/min,接种量5%,摇床振荡培养4d,发酵液

9、多糖产量较高.4.学位论文 杨振芳 球孢虫草(Cordyceps bassiana)生物学特性及活性成分研究 2009本文以球孢虫草为实验材料，利用菌种分离技术、PCR、高效液相色谱等技术和化学手段，对球孢虫草的生物学特性和化学成分进行了研究，主要包括以下内容：球孢虫草无型性确定和生活史验证，液体深层发酵条件及人工栽培条件优化，球孢虫草中蛋白质、氨基酸、甘露醇、多糖和核苷类物质的研究及多糖和小分子物质的活性测定。研究结果如下：1.球孢虫草无型性确定和生活史验证：采用形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合，确定了球孢虫草的无型性为球孢白僵菌。在此基础上对球孢白僵菌进行了生活史验证，从而有力的证明了球孢

10、虫草与球孢白僵菌是同一物种的不同生长阶段，球孢虫草是有型性，而球孢白僵菌为无型性。2.液体深层发酵条件及人工栽培条件优化：以EPS和菌丝体生物量为指标，由单因素实验和正交实验确定了该菌株液体发酵最佳培养基的组成为：蔗糖25、蛋白胨39，(NH4)2SO41.5、K2HPO41.5、MgSO40.5；由单因素实验确定了液体发酵条件为：初始pH7.0、温度26、装液量75mL/250mL、接种量5、培养时间3d。在最佳的培养基和培养条件下，该菌株产EPS量高达1.8279/L，菌丝体生物量达2.1359/100mL。以子实体质量和产量为指标，由单因素实验和正交实验，确定了人工栽培的最佳条件为：麦粒

11、为原料，含水量70，培养温度2224，PH值7.0。3.活性成分分析：研究发现，球孢虫草子座和菌丝体中蛋白质含量分别为：35.32、24.05，低于野生冬虫夏草，但氨基酸含量高于冬虫夏草，分别为25.96、16.51；球孢虫草菌丝体中甘露醇含量高达12.05，高于子座和野生冬虫夏草。采用GC和HPLC分别测定了球孢虫草多糖的单糖组成和核苷类物质的含量及组成，结果表明，球孢虫草胞外多糖(EPS)由甘露糖和半乳糖组成，摩尔比是1.2:1.0；胞内多糖(IPS)由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，摩尔比为5.4:4.0:1.0。球孢虫草子座与发酵菌丝体中均含有鸟苷、腺苷和尿苷三种成分，且发酵菌丝体中三者的

12、含量高于子座及野生冬虫夏草。通过五种活性成分测定，为综合评价球孢虫草内在品质和开发球孢虫草提供了科学依据。4.活性测定：通过对多糖体外抗氧化活性研究发现：IPS具有清除DPPH、OH、O2和螯合Fe2+的作用，有强的还原力；EPS仅可以清除OH，螯合Fe2+，对DPPH和O2均没有清除作用，也没有还原力。IPS和EPS对革兰氏阳性菌的抑菌效果较好，对革兰氏阴性菌基本没有抑菌作用；乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对选取的菌种均有较好的抑菌活性。由于虫草胞外多糖可直接通过液体发酵获得,操作方便。本文将近年来在虫草胞外多糖液体发酵方面所做的研究工作进展进行总结,以期为今后的利用开发提供参考。采用摇瓶培养

13、方法,以菌丝体干质量为指标,通过单因素和正交试验,对虫草液体发酵培养基组成进行研究.结果表明,虫草液体最优发酵培养基组成为:葡萄糖2.0%,蛋白胨4.0%,KH_2PO_4 0.20%,MgSO_40.10%,在该条件下菌丝体干质量平均可达15.64 mg/mL.7.学位论文 傅岚 古尼虫草液体深层发酵及化学成分的研究 2004该文以产于湖南浏阳市的古尼虫草Cordyceps gunnii(Berk.)Berk.及深层发酵的古尼虫草菌丝体为实验材料,利用菌种分离技术,液体深层发酵、PCR、柱层析、纸层析、紫外、红外光谱技术和化学反应等手段,对古尼虫草菌丝体液体发酵培养条件及部分化学成分进行了研

14、究,主要包括以下内容:古尼虫草液体种子培养基及培养条件的筛选,发酵罐深层发酵生长曲线的测定,古尼虫草子座和古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii)ITS序列的分析,菌丝体多糖的分离纯化及结构测定,古尼虫草的碱溶性多糖、甘露醇的提取方法及含量研究.9.学位论文 罗建光 液体发酵条件对虫草（Cordyceps sinensis）菌丝体有效成分、免疫及抗氧化活性的影响 2007本研究采用正交实验方法对冬虫夏草CS-1菌株(Cordyceps sinensid cs-1)进行了深层液体发酵，测定了菌丝体生物量，用苯酚-硫酸法、3，5-二硝基水杨酸法以及HPLC法等方法对菌丝体热水提取物中胞

15、内总糖、还原糖、多糖及尿苷、腺苷和虫草素等含量进行测定，筛选在生物量、胞内多糖和核苷产量等指标上的优化发酵条件；同时对提取物免疫活性、抗氧化及保护氧化损伤作用等进行研究。CS-1菌株的生物量最佳培养条件为发酵温度为18、pH为6.5、发酵时间为9天，菌丝体生物量达到20.3950.178g/L发酵醪液。在不同的正交实验条件下，菌丝体水提物中总糖平均为279.3743.3mg/g，低于天然虫草提取物中的总糖(374.087.45mg/g)；菌丝体中还原糖平均为40.968.85mg/g儋，远低于天然虫草163.811.1mg/g。而菌丝体提取物中多糖在192.43312.90 mg/g范围内，平

16、均为238.3937.75 mg/g，高于天然虫草210.271.19mg/g；胞内多糖得率最佳培养条件为发酵温度为22、PH为6.5、发酵时间为6天。在发酵温度为25、pH为7.5、发酵周期为3天，对腺苷、尿苷、虫草素形成有利，菌丝体中腺苷含量达到2.448 mg/g，是天然冬虫夏草生药的5.9倍，并远超过药典规定的0.010(0.1 mg/g)质量标准。FRAP法检测结果发现，不同发酵条件下的提取物平均抗氧化活性，可达天然虫草水提物活性的84.6；抗氧化活性最佳的培养条件为25、pH为4.5、发酵时间为6天。25、pH为4.5、发酵时间为6天条件下，提取物抗氧化活性最高。以HO，损伤的PC

17、12为模型，研究发现不同发酵条件下的提取物对HO氧化损伤PC12细胞的保护活性与天然虫草提取物相当；保护氧化损伤活性最佳培养条件为22、pH为4.5、发酵时间为6天。 中性红比色法结果显示，不同浓度的虫草菌丝体水提物均能提高小鼠单核巨噬细胞Raw264.7吞噬中性红的能力，并有量效关系。；培养条件为28、pH为4.5、发酵时间为3天时，促Raw264.7细胞吞噬活性最高。MTT法检测显示，菌丝体提取物在0-100g/ml浓度范围可显著刺激小鼠脾细胞增殖但浓度达到20g/ml时反而抑制增殖。在ConA存在时，虫草菌丝体提取物在在50-20g/ml范围内抑制小鼠脾细胞增殖。这些结果表明虫草菌丝体提取物的免疫调节作用是双向的。正交直观分析显示，脾细胞增殖活性最佳的发酵为28、pH为4.5、发酵时间为