小鼠部分组织的石蜡切片制作

1、小鼠部分组织的石蜡切片制作一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精， 而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡 对组织进行包埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬 度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下 可以清晰地观察其组织结构。二、材料与用具1材料：小鼠肝脏、脾脏等。2用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。三、实验内容与步骤1取材及固定取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边 长约为 0.5cm 的组织块。用先用 0.85的生理盐

2、水漂洗以洗去血液与污渍，如 果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理 盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死 后 24hr 。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免 组织自溶或上皮剥落。取下的材料马上进行固定，采用 FAA固定液，固定液的用量与组织块体积 之比一般在 20:1，固定时间 2 hr 以上，超过 24hr 时可继续浸泡或转入 70%酒精 中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动 物品种及开始固定的时间。2冲洗固定后的组织块在

3、进行脱水前用 70%酒精洗去固定液。3脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒 精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔 化的石蜡浸渗到组织中创造条件。常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓 度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明 和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的 收缩变形。脱水所用的酒精浓度及过程如下：30% 5% 7% 8% 9% 9% 10%（I） 10%（n）组织块在各级较低浓酒精（小于 70%）中脱水的时间应视组织块的大小而 定，大

4、小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为 612 hr,在高浓度酒精中（大于70%） 脱水时间为3 hr左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水 分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点,故在无水酒精中脱水的时间不宜过 长,一般应在 1530min 左右。在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50:1。简化步骤如下：70%（一夜） 80%（1 hr）90%（30 分） 95%（30 分） 100% （15分） 酒精+二甲苯（ 15分） 二甲苯（ 3分） 石蜡+二甲苯（ 30 分） 石蜡（ 80 分）4透明透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精，以便

5、于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是 能分别与石蜡和酒精相溶的。经过透明剂处理的组织块用肉眼对光观察呈透明 现象，所以这个过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等，这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂，因此透明的时间宜短，一般在 20 min即可。透明时组织块由无水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中 1hr 左右，然后取出放入 纯二甲苯中 20 min 即可。5浸渗浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中，然后再通过各 种方法使这种物质凝固，而将组织材料包埋其中。石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程。石蜡切片法是将加热的石蜡 渗到组织中而火棉胶切片法是

6、使火棉胶渗到组织间隙中去。在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中，使其杂质沉淀。石蜡最好选用软蜡和硬蜡两种，软蜡熔点为4550C之间，硬蜡熔点为5658C之间，6062C的硬蜡很少用。冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温 较高时多用硬蜡。浸渗应在自动恒温箱中进行。组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下：软蜡 130min软蜡 230min硬蜡 130 60min硬蜡 260 120min这一时间不是固定不变的，应视组织块的种类及大小而相应延长或缩短浸蜡时间。浸蜡的总时间一般为： 0.5立方厘米的组织块时间为 68 hr；0.20.3 立方厘米的组织块时间为 35hr; 0.10.2立方厘米的

7、组织块时间为 23 hr。 当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉淀或过滤后再使用。浸蜡不透包埋 后会出现白色不透明部分，此时需要在浸蜡一次。6包埋包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中，石蜡包埋法如下。浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡 槽内，然后从第四个蜡杯中取出组织块，放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切 面的摆放方向。放好组织后可以自然冷却，也可以放入冷水中直接冷却。7修块和切片取已经包埋好的蜡块，将纸盒拆下，用加热的刀片或解剖刀将其分成若干 块（每块组织占一块），用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去，注意不要切 到组织。把有组织的蜡块修成正方形或梯形。在进

8、行塑型时一定要注意组织块 切面的方向。蜡块塑好后将其粘在小木块上。注意要粘牢。最后在木块侧面用铅笔记上组织块名称、编号。切片时采用手摇连续切片机。使用切片机进行切片时，将蜡块固定在切片 机上，调好距离和所要求的切片厚度，然后用右手摇动手柄，即可进行切片 了。一般来讲生物切片的厚度在 510微米。对于切下的切片不要用手去取，因为体温可以使蜡片粘到手上，正确的做 法是用毛笔或牙签挑取，然后放在载玻片上进行展片和粘片。8展片和粘片切下的组织蜡片往往带有皱褶，所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘 片，即把切好的蜡片平整的粘在载玻片上。展片的温度因石蜡熔点的不同而的 不同，一般的5658C的石蜡切片C的温

9、水进行展片，4852C的石蜡切片用 35C的温水进行展片。等到蜡片充分展平后，取一清洁载玻片，载玻片上涂一 薄层蛋白甘油，然后在水中捞取蜡片，捞完后将蜡片摆正，放到格盘内，置 38C温箱中烘干，然后即可进行染色。展片和粘片比较简单容易做，但是如果处理不好则无法进行染色，即使能 染上色，组织切片内部的结构也往往被破坏。9染色和封固采用苏木精伊红对染法(H巳染色结果是细胞核为紫色，细胞质为粉红色；苏木精伊红染色法整个染色过程如下：取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡 10min 左右，这个过程 称为脱蜡。脱完蜡后的切片即可进行染色，具体染色过程和时间如下：(1) 100%酒精洗去二甲苯25

10、min。(2) 95%酒精 25min。(3) 90%酒精 25min。( 4) 80%酒精 25min。( 5) 70%酒精 25min。(6) 50%酒精 25min。( 7)蒸馏水洗 25min。( 8) xx 精染液 10 20min。( 9)普通水洗 1min。(10) 盐酸酒精分色数秒半 min (70%酒精100 mL+盐酸1 mL),分色到切片为带粉红色后立即取出。(11) 自来水冲洗数hr。镜检切片呈清朗的蓝色，细胞核非常明显。( 12)蒸馏水洗 1min。(13) 50%酒精 25min。(14) 70%酒精 25min。(15) 80%酒精 25min(16) 伊红酒精溶液对比染色25min (95%酒精+ 0.5g伊红)。(17) 95%酒精 25min。(18) 无水酒精I 3min。(19) 无水酒精II 3min。( 20)无水酒精加等量二甲苯 2min。( 21 )二甲苯数 min 到透明为止。( 22)自二甲苯中取出切片，放在格板内，滴少量的树胶于组织片中央。( 23)取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片，然后迅速放下盖玻 片，树胶即迅速扩张到四周，校正好盖玻片方向。将封好的切