大鼠胰岛细胞培养法

1、大鼠胰岛细胞培养法 胰岛散在于胰外分泌组织中呈岛状，是由数千个细胞组成的小器官。惟独分别、收集胰岛才有可能解析其固有功能。胰岛从外分泌腺组织中分别称胰岛单离，尽管已建立了多种办法，但获得较高纯度的胰岛细胞仍较困难。胰岛细胞培养的应用极为广泛，如胰岛细胞代谢、细胞分泌激素及激素合成机制的解析，细胞表面抗原，细胞受体及细胞带电现象的讨论，胰岛肿瘤化及对其有害药物的讨论，以及胰岛移植的应用等。 【材料】 1胰岛单离法 (1）组织来源：大鼠（250g左右）12只。 (2)试剂：hanks液；胶原酶, i型或v型）；或。 (3）器具：各种吸管，试管（吸管与试管最好硅化处理），35 mm塑料培养皿，玻璃蒸

2、发皿（约50 mm左右）。解剖器具一套，20m1注射器，针头接4号静脉导管或2123g翼状头皮针头，弥漫hanks液。恒温振荡器（180200r/min )。 2.胰岛收集法 (1)胶原酶消化后的胰组织。 (2) ficoll-conray液：如表4-2制备450ml a液，然后应按adcb挨次，分离制备b,c,d液。 a液：fico11400终浓度8.3%,conray400（碘他拉酸钠sodium iotalamate 66.8%溶液）终浓度11.1%，加lmg/ml，50ug/ml,0.002等制成水溶液，高压灭菌后用nahc03调节至ph 7.4,a液比重为1.095，渗透压396mo

3、sm/l。 b液：在c液中加入等量的a液 c液：在d液中加入等量a液 d液：在a液中加等量灭菌蒸馏水 （3）hanks液 (4）各种吸管、试管、离心管（最好硅化） (5）涡旋混匀器 3.胰岛细胞簇拥法 (1）单离胰岛细胞100500个。 (2）培养基：mem,dmem或rpmi 1640+510（fbs)。 (3）消化液：中性蛋白酶(dispase,1000u/ml),0.020.04% edta/cmf液，无钙镁hanks液（cmf-hanks液）。 (4）器具：各种吸管，15 ml离心管，磁心棒（径15mm),10ml三角烧瓶（底面平坦便于磁心棒旋转，放入磁棒后高压灭菌），35 mm塑料培

4、养皿或24孔，96孔微量培养板，细胞计数器一套，恒温磁力搅拌器。 【办法】 1胰岛单离法 （1)摘取胰腺： 1)鼠在或戊巴比妥麻醉下固定四肢，开腹，找到肝、脾、胃和十二指肠等脏器的位置，切断肝叶间隙薄膜，反转至头侧，裸露胆总管的走行，在胆总管的末梢十二指肠开口处近肝侧留一把无钩钳，在有副胰管的状况下也留一把钳（图4-6)。 2）从肝管分支部向十二指肠侧周围组织中分别胆总管，绕一结扎线，于此部用剪刀剪开胆总管一小口，立刻见黄色胆汁逆流溢出，从今口插入静脉导管的注射器，行向十二指肠并结扎固定（用翼状头皮针时可不剪开小口）。徐徐注入hanks液约20m1，液体经胆总管逆流至胰管内，使其膨胀至胰尾，用

5、镊子纯性剥离膨胀的胰腺并摘取下来，去除附着的脂肪组织与淋巴结等。 (2）消化胰腺：将膨胀的胰腺移至蒸发皿内，用眼科剪剪碎至lmm以下，倒入hanks液，组织片沉下，去除飘荡的脂肪和膜等组织，移至试管内尽量吸掉hanks液，留细切胰组织容量约为1 ml时，加入5 mg胶原酶粉，严密封盖后将试管置37恒温水浴振摇器上，沿着试管长轴水平振荡180200次分钟，约810分钟，取出试管振摇56秒，见组织片细薄均等，并附着于管壁，或在管壁上有约0.5 mm大小透亮斑点附着，此状表示消化终了。 (3）收集消化细胞：于消化终了的胰腺组织试管中加入适量hanks液，1200r/min离心1分钟，去上清液，如此再

6、洗涤一次，如在沉渣中见有黏蛋白样物质，则用毛细吸管吸掉。 2胰岛收集法（图4-7) (1）于上法得到的沉渣中加a液（ficoll-conray) 3 ml,在涡旋混匀器上混合后，再用1 ml a液洗落附在管壁上的组织片，吹吸混匀，静置后沿管壁渐渐分层加入b,c,d液各2ml,3000r/min，离心10分钟，如彻低单离时，胰岛将集中在c-d界面上。 (2）用毛细滴管从c-d界面取出胰岛集中于离心管中，加hanks液吹吸混匀后，1200r/min离心1分钟，反复洗涤2次，最后用培养基悬浮培养。 3.胰岛细胞簇拥法 (1)单离的胰岛用毛细管移至离心管内，1200r/min离心23分钟，去上清。加入

7、edta液5 ml，室温置5分钟，并间隔振摇，再次离心，去上清液；加入dispase液1 ml混匀，静置，待胰岛沉淀，用毛细管吸上清液移至一个带磁心棒的三角烧瓶内，同样操作反复加dispase液，总量用尽4ml，注重在移加时不要走失胰岛。将三角烧瓶放磁力搅拌器上，37，80100r/min搅拌15分钟（图4-8）。 (2)用毛细管轻轻吹打数次使其簇拥，将三角烧瓶斜置，当未消化的胰岛下沉时，吸出上清液约3 ml收集于离心管中再补加23 ml培养基。在三角烧瓶中加dispase液3 ml,进一步消化巧分钟，同样收集上清单个细胞，共消化3次可使单离胰岛彻低簇拥。离心洗掉dispase液以停止消化。集中的单个细胞最后用1200r/m