细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究

1、细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究 09-08-27 11:29:00 编辑：studa20 作者：王和 罗振华 徐艳 梁菁苹【摘要】 目的 检测与分析细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因，探讨细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因基础。方法 分别分离16株自发形成和用利福平、异烟肼、乙胺丁醇诱导形成的结核分枝杆菌的染色体DNA，PCR扩增IS986序列以及rpoB、katG和embB基因后进行凝胶电泳和序列分析。结果 自发形成及抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型可在含利福平(4g/ml)、异烟肼(0.2g/ml)、乙胺丁醇(7.5g/ml)的培养基内生长与传代培养。基因检测与分析显示

2、，结核分枝杆菌稳定L型仍然保留IS986基因，rpoB、katG、embB基因也未见突变。结论 结核分枝杆菌稳定L型可自发形成，也可被利福平、异烟肼和乙胺丁醇诱导形成。结核分枝杆菌稳定L型对利福平、异烟肼、乙胺丁醇形成耐药性，但其染色体上耐药相关基因并没有发生突变。除染色体耐药相关基因突变可造成结核分枝杆菌形成耐药性外，细胞壁缺陷也是造成结核分枝杆菌形成耐药性的一个重要机制。 【关键词】 结核分枝杆菌； 细胞壁； 基因； 耐药性 ABSTRACT Objective To determine and analyze the genes related to drug resistance, a

3、nd probe the properties of drug resistance genes of Mycobacterium tuberculosis. Methods The sequence of IS986 and the genes of rpoB, katG and embB were isolated respectively from the L-forms derived spontaneously and induced by rifampin, isoniazid and ethambutol respectively from 16 strains of M.tub

4、erculosis, and then the genes were determined by agarose gel electrophoresis and analyzed by direct sequencing. Results The both of L-forms derived spontaneously and induced from M.tuberculosis were grow well and be subcultured in the non-high osmotic liquid media with rifampin (4g/ml), isoniazid (0

5、.2g/ml) and ethambutol (7.5g/ml) respectively. The sequence of IS986 and the genes of rpoB, katG and embB were held in the stable L-forms and no gene mutation was found in them. Conclusion The L-forms were formed spontaneously or induced by rifampin, isoniazid and ethambutol. The L-forms derived eit

6、her spontaneously or induced by the antibacterial drugs from drug susceptible strains of M.tuberculosis revealed the resistance to rifampin, isoniazid and ethambutol but no gene mutation of rpoB, katG and embB could be found in the variants. It was considered that the cell wall deficiency was an imp

7、ortant resistant mechanism of M.tuberculosis besides the chromosomal gene mutation. KEY WORDS Mycobacterium tuberculosis; Cell wall; Gene; Drug resistance 细胞壁缺陷是结核分枝杆菌最常发生的变异现象之一，被认为是结核分枝杆菌生命周期独特的一个形态时期或相1。然而近年的研究2发现，结核分枝杆菌不仅可在人工培养基及动物体内自然发生细胞壁缺陷变异，而且也可在利福平、异烟肼和乙胺丁醇等抗结核药物的诱导下发生细胞壁缺陷变异以及在含高浓度抗结核药物的培养

8、基内传代培养。文献3报道，结核分枝杆菌耐药性的形成主要同其染色体上耐药性相关基因突变有关，尚未发现质粒等其他细菌所具有的耐药性机制。为探讨细胞壁缺陷导致结核分枝杆菌形成耐药性的基因机制，本文采用基因检测与分析的方法，对自发形成和抗结核药物诱导形成的细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因进行了检测与分析，现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 (1)菌株 16株结核分枝杆菌(Mycobactium tuberculosis)分别为质控菌1株(H37Rv，R#934，编号93009)，中国药品生物制品检定所提供，本室编号Mk；临床分离菌15株，获自贵阳市肺科医院住院肺结核患者痰标本，本室

9、编号M1M15。 (2)培养基 苏通培养基，按文献4方法制备。 (3)诱导剂 利福平胶囊(rifampin，RFP)，批号：国药准字H21021905，沈阳红旗制药有限公司提供；异烟肼片(isoniazid，INH)成都锦华药业有限公司提供，批号H51020788；乙胺丁醇片(ethambutol，EMB)批号010101，成都锦华药业有限公司提供。 (4)结核分枝杆菌基因检测试剂盒 扩增结核分枝杆菌染色体DNA重复保守序列IS986，引物碱基序列为5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3，5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3，扩增产物分子量为245bp。华美生物工程公司提

10、供，批号20050501。 (5)结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒 rpoB基因检测试剂盒 扩增序列涵盖rpoB基因的第507至533位密码子，rpoB基因外套引物碱基序列为rpoB P1：5-CGTGGAGGCGATCACACCGCA-GACGTT-3，P2：5-AGTGCGACGGGTGCACGT-CGCGGACCT-3，扩增片段215bp；内套引物碱基序列为rpoB P3：5-CGTGGAGGCGATCACACCGCA-GACGTT-3，P4：5-GACCTCCAGCCCGGCACG-CTCACCT-3，扩增片段193bp，无锡市克隆遗传技术研究所提供，批号050613。 katG基因检测

11、试剂盒 上游引物5-AGCTCGTATGGCACCGGAAC-3，下游引物5-TTGACCTCCCACCCGACTTG-3，扩增katG基因904、1523bp(620bp)，扩增片段为katG基因突变热点区，包括315、321、381、406、409、418、441、456、463和476位，无锡市遗传克隆技术研究所提供，批号050613。 embB基因检测试剂盒 embB基因外套引物的碱基序列为E15-CGGCCTGCATCGTCGCCGGG-3、E2 5-GATCCACAGACTGGCGTCGCTG-3，内套引物E3 5-CGGCATGCGCCGGCTGATTCC-3、E4 5-TCAT

12、CAGCGCCAGCAGGTTGTAA-3；E1、E2引物扩增embB基因自77218002共282bp碱基序列，E3、E4引物扩增embB自77417973共233bp碱基序列，第二次扩增的片段包括embB的突变热点区，即第285位、306位、和330位共77个密码子(233个碱基)，扩增产物分子量为233bp，无锡市遗传克隆研究所提供，批号分别为021211、031013、030610、040503。 (6)PCR产物纯化试剂盒 Ultra Clean PCR Clean-up Kit，美国MOBIO公司提供。 (7)PCR测序试剂 BigDye Terminator Kit，美国PE公司

13、提供。 1.2 方法 (1)菌种鉴定 用BACTEC-TB460检测系统以及结核分枝杆菌基因检测试剂盒推荐的方法，对各菌株分别进行菌种鉴定，染色体IS986序列PCR扩增与检测，RFP、INH和EMB敏感性测定以及rpoB、katG和embB基因的PCR扩增与序列分析。 (2)稳定L型诱导与分离 根据各菌株的药物敏感性及其耐药相关基因检测结果，选择rpoB基因未发生突变的Mk、M4、M5菌株和突变的M13菌株，katG基因未发生突变的M15菌株和突变的M5、M8菌株以及embB基因未发生突变的M2、M4、M5、M6、M7、M8菌株。按文献2方法将各菌株分别接种于不含药物的苏通培养基，将rpoB

14、未突变菌株接种于含RFP 0.1、0.2、0.4g/ml以及突变菌株接种含RFP 1、2、4g/ml的苏通培养基；将katG未突变及突变菌株接种含INH 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08g/ml的苏通培养基，将embB基因未突变菌株接种含EMB 1、2.5、5、7.5、10g/ml的苏通培养基，置普通温箱内37培养和分离L型。 (3)稳定L型鉴定 按上述菌种鉴定的方法，分别提取各菌株自发形成和诱导形成的L型的染色体DNA，进行IS986序列PCR扩增与检测。 (4)稳定L型药物敏感性检测 取自发形成及RFP、INH、EMB诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型纯培养物，分别接种于含不同浓度RFP(1、2和4g/ml)、INH(0.2g/ml)及EMB(7.5g/ml)的苏通培养基内