冻干鲤鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留测定的两种前处理方法比较_

1、227分析检测食品科学2011, Vol. 32, No. 02冻干鲤鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留测定的两种前处理方法比较赵 艳1，王丽敏1，刘耀敏1，张凤枰1,2,3, *(1.通威股份有限公司，四川 成都 610041；2. 中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810001；3. 中国科学院研究生院，北京 100049摘要：采用固相萃取和液液萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS，对冻干鲤鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留量进行测定，比较两种前处理方法的测定结果。固相萃取法：样品经EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液提取，HLB 固相萃取柱净化，氮气浓缩；液液萃取法：样

2、品经酸性乙腈溶液提取，正己烷液液萃取净化，旋转蒸发浓缩。两种方法的提取液浓缩定容后，以超高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。固相萃取和液液萃取法的回收率分别为95%112%和75%90%，RSD 分别为2.9%7.4%和1.0%4.6%，检出限分别为1.0g/kg和0.10.2g/kg。结果表明，两种方法简便快速、重现性好、选择性强，均适用于鱼肉和冻干鲤鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留的测定。关键词：恩诺沙星；环丙沙星；残留；冻干鲤鱼粉；超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MSComparison of Two Pretreatment Methods for UPLC-MS/MS

3、Determination of Enrofloxacin andCiprofloxacin Residues in Freeze-dried Carp MealZHAO Yan1，WANG Li-min1，LIU Yao-min1，ZHANG Feng-ping1,2,3, *(1. Tongwei Co. Ltd., Chengdu 610041, China；2. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences,Xining 810001, China；3. Graduate University o

4、f Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, ChinaAbstract ：Sample pretreatment was achieved by two different methods, solid-phase extraction and liquid-liquid extraction,before the analysis of enrofloxacin and ciprofloxacin residues in freeze-dried carp meal on UPLC-MS/MS. The analytical resultsw

5、ere compared to examine if the two pretreatment methods influence the accuracy of determination. The solid-phase extractionprocedure was composed of extraction with EDTA-Mcllvaine buffer, clean-up on HLB column and blowing to dryness undernitrogen gas. Liquid-liquid extraction pretreatment was achie

6、ved sequentially through extraction with acidified acetonitrilefollowed by clean-up by liquid-liquid extraction with n-hexane and evaporation to dryness in a rotary evaporator. Both residueswere dissolved in 1 mL of mixed solution of acetonirile and 0.2% formic acid (1:9, V/V prior to injection into

7、 UPLC-MS/MSsystem. For the quantitation of enrofloxacin and ciprofloxacin, external standard method was used. Average spike recoveries ofsolid-phase extraction and liquid-liquid extraction ranged from 95% to 112% and from 75% to 90%, with relative standarddeviations between 2.9% and 7.4% and between

8、 1.0% and 4.6%, respectively (n = 6. The limits of detection (LOD of solid-phase extraction for the two analytes were both 1.0g/kg, and the LOD of liquid-liquid extraction was 0.1g/kg for enrofloxacinand 0.2g/kg for ciprofloxacin. As a conclusion, both methods are characterized by simplicity, rapidi

9、ty, good reproducibility and highselectivity, and therefore can be used to determine enrofloxacin and ciprofloxacin residues in fish meat and freeze-dried carp meal.Key words：enrofloxacin ；ciprofloxacin ；residues ；freeze-dried carp meal；UPLC-MS/MS中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(201102-0227-04收稿

10、日期：2010-03-01作者简介：赵艳(1983 ，女，工程师，硕士，研究方向为食品质量安全检测。E-mail ：zhao518yan* ：恩诺沙星和环丙沙星属于喹诺酮类(qui no lo n es ，QNs 药物，由于其抗菌作用强、抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，而且价格低廉，已成为兽医临诊和水产养殖中重要的抗感染药物1。但是，动物用药后2011, Vol. 32, No. 02食品科学分析检测228的药物残留可以通过食物链传递，会引起人体不良反应，影响人体健康。因此，对动物体内喹诺酮类药物残留量的检测已越来越受到人们的关注。目前常见的喹诺酮残留检测方法主要有酶联免疫法2-3、高效毛

11、细管电泳法4、液相色谱法5-8和液相色谱-串联质谱法9-14。本实验采用固相萃取和液液萃取两种方法对样品进行前处理，以超高效液相色谱-串联质谱测定，比较了两种前处理方法的测定结果和优缺点，为水产品及其制品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测提供参考。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器鲤鱼 鲜鱼2000g ，放血、去鳞、去内脏、去皮，取背部肌肉搅碎；冻干鲤鱼粉 威海出入境检验检疫局。乙腈、甲醇、正己烷、甲酸(均为色谱纯 美国Fis h er 公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠(均为分析纯 国药集团化学试剂公司；环丙沙星(纯度94.0%、恩诺沙星(纯度99.0% 德国Dr Ehrenstofer公

12、司；水为Milli-Q 超纯水；Oasis HLB 6mL/200mg固相萃取小柱 美国Waters 公司。AcQuity TM -TQD 超高效液相色谱-串联质谱仪 美国Waters 公司；MTN-2800氮吹仪 天津奥特赛恩斯公司；R-210旋转蒸发仪 Buchi公司；KQ5200B 型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Allegra 64 R离心机 Beckman Coulter公司；CP224S 电子分析天平 Sar-to riu s 公司。1.2标准溶液和提取溶液的配制分别准确称取适量恩诺沙星和环丙沙星标准品，用乙腈溶液配制成0.2mg/mL的标准储备液，18避光保存。液相色谱条

13、件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm ，1.7m ；流速：0.2mL/min；柱温：35；进样体积：10L 。流动相：A 为甲醇-乙腈溶液40:60(V/V ，B 为体积分数为0.2%甲酸溶液；梯度洗脱条件见表1。9070101090表1 梯度洗脱条件Table 1 UPLC gradient elution conditions串联质谱条件电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+ ；检测方式：多反应监测(MRM ；毛细管电压：1. 2k V ；透镜电压：0. 1V ；离子源温度：120；脱溶剂气温度：350；脱溶剂气流量：650L

14、/h 。定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。化合物母离子(m/z 子离子(m/z 锥孔电压/V碰撞能量/eV环丙沙星360.044526表2恩诺沙星和环丙沙星的质谱参数Table 2 Qualitative and quantitative ions, cone voltage and collisionenergy for enrofloxacin and ciprofloxacin in MS/MS analysis注：*. 定量离子。1.4固相萃取法提取称取试样0.5g(精确至0.1mg ，置于50mL 聚四氟乙净化基质加标标准工作曲线的制备移取一定体积的标准储备液，用初始

15、流动相稀释成1.0g/mL质量浓度的混合标准溶液。取阴性样品5份，依次加入一定量的混合标准溶液，按照以上方法处理，得到质量浓度分别为2、5、10、30、60ng/mL的系列标准溶液。1.5提取净化将上清液转移到预先加有25mL 乙腈饱和的正己烷的分液漏斗中，充分振荡、静止分层，弃去上层溶液，OROR229分析检测食品科学2011, Vol. 32, No. 02标准工作曲线的制备移取一定体积的标准储备液，用初始流动相稀释成 质量浓度1.0g/mL的混合标准溶液，将混合标准溶液稀释成质量浓度为0.5、1、10、30、60ng/mL的标准溶液。2结果与分析2.1两种前处理方法的优化 恩诺沙星和环丙

16、沙星在多数溶剂(包括水 中溶解性较差，而易溶于含水相(质子化或酸解离 的酸性溶液，因此两种提取方法中的提取液均为酸性溶液。 实验发现，固相萃取法中用缓冲液提取时容易乳化，造成离心不完全，上柱时柱子容易堵塞。比较用4、l0、20mL 提取液上柱浓缩，发现4mL 提取液上柱，处理时间短，且回收率理想，最终确定用4m L 提取液进行过柱。液液萃取法中用组织渗透力强的乙腈并在其中添加2%甲酸作为提取溶剂进行提取实验，结果表明，该提取试剂不仅除蛋白的效果好，而且容易浓缩。然而将20mL 提取液全部用来浓缩，回收率仅50%，且杂质干扰严重。实验比较了用4、l0、20mL 提取液进行浓缩，发现4m L 提取

17、液浓缩效果最佳，回收率均大于70%，最终确定用4mL 提取液进行浓缩。2.2流动相的选择环丙沙星、恩诺沙星结构式中含有羧基和哌嗪基，属于酸碱两性化合物，因而流动相的pH 值可能会对灵敏度造成一定的影响，在流动相中加入甲酸，可以有效改善峰形，增加其离子化效率。实验证明，0.2%的甲酸-乙腈溶液比0.1%的甲酸-乙腈作流动相检测灵敏度高，且峰形较佳。然而当pH 值过低时，会对色谱系统的寿命有影响。故本研究以0.2%的甲酸-乙腈溶液为流动相，采用梯度洗脱的方法，可获得较好的实验结果(图1 。图1加标鱼肉样品的离子色谱图(加标量10g/kgFig.1 Ion chromatograms of fish

18、 meat spiked with standards(at 10g/kg方法化合物线性范围/(g/L回归方程相关系数检出限/(g/kg定量限/(g/kg0.560Y =263.0780X 8.54030.99960.20.7表3恩诺沙星和环丙沙星的回归方程、检出限(LOD和定量限(LOQTable 3 Linear regression equations and limits of detection and quantification of enrofloxacin and ciprofloxacin化合物 固相萃取法液液萃取法检测结果/(g/kg回收率/%回收率校正结果/(g/kgZ

19、 值检测结果/(g/kg回收率/%回收率校正结果/(g/kg99.1100.598.61.1578.779.399.21.11表5恩诺沙星和环丙沙星在冻干鲤鱼粉中的检测结果Table 5 Contents of enrofloxacin and ciprofloxacin in freeze-dried carp meal determined based on two different sample pretreatment methods100505.83相对丰度/%510环丙沙星m/z 332.1m/z 288.15.21×1041.51相对丰度/%510环丙沙星m/z 33

20、2.1m/z 3142.11×104100506.34相对丰度/%510恩诺沙星m/z 360.04m/z 245.14.85×104100506.33相对丰度/%510恩诺沙星m/z 360.04m/z 316.19.26×104100502011, Vol. 32, No. 02食品科学分析检测230化合物添加量/(g/kg固相萃取法 液液萃取法回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%495.83.272.61.0表4空白样品加标回收率和测定的相对标准偏差(n =6Table 4 Recoveries and relative standard deviati

21、ons for enrofloxacinand ciprofloxacin blank samples spiked with standards (n =62.3方法线性范围、检出限和定量限分别以恩诺沙星和环丙沙星的响应面积为纵坐标、以质量浓度为横坐标，进行线性回归，以3倍信噪比计算检出限(LOD，以10倍信噪比计算定量限(LOQ。线性方程、检出限和定量限见表3。固相萃取和液液萃取检出限分别为1.0g/kg和0.10.2g/kg。2.4回收率与精密度比较以阴性鲤鱼背部肌肉为代表，按照上述两种处理方法分别进行样品分别添加4、10、20g/kg 3个水平的添加回收试验，每个水平下做6次平行实验，

22、结果见表4。3结论本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法测定冻干鲤鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留，通过对固相萃取和液液萃取两种方法的方法学考察和样品测定结果进行比较，表明这两种方法的提取效率不存在显著差异，但两种方法在耗费时间、溶剂使用量和所需设备的成本方面存在较大的差异；固相萃取法的回收率高、液液萃取法的检出限低，但样品测定结果用添加回收校正后均能得到满意的结果，两种前处理方法都可以满足水产品中恩诺沙星和环丙沙星的检测要求，分析人员可以根据具体的实验条件选用不同的处理方法。参考文献：1李俊锁, 邱月明, 王超, 等. 兽药残留分析M. 上海: 上海科学技术出版社, 2002: 228-264.2

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