dna连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法

1、DNA连接反应的影响因素&提高平端连接效率的方法&外源和质粒载体的连接反应&平端连接接反应1、 连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多 用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L， 作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是 连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的

2、ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol /L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L 时，去磷酸载体的自环比例

3、最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于 -20保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长 期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。4、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37。为了解决这一矛盾，在经 过综合考虑后，传统上将连接温度定为16，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端

4、来说，20 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。5、 酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。6、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物， DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。在

5、用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓 度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。提高平端连接效率的方法：1、 低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。2、 在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。足够多的载体和插入片段是最重要的 。要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环

6、化的。插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。 载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50100ng。3、 平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22度2小时后4C过夜。4、 尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。5、 建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。（一）外源和质粒载体的连接反应外源片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成个新的磷酸二酯链。但如果质粒已去磷酸化，则吸能形成个新的磷酸二酯

7、链。在这种情况 下产生的两个杂交体分子带有个单链切口，当杂本导入后可被修复。相邻的'磷酸和'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌连接酶和噬菌体连接酶。实际上在有用途中，噬菌体连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端片段连接起来。一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的末端的浓度决定。不论末端位于同一分子（分子内 连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷 酸化载体。在瓜作用的底物。如

8、果反应中浓度低，则配对的两个末端同一分子的机会较大（因为分子的一个末端找到同一分子的另一末端 的概率要高于找到不同分子的末端的概率）。这倦，在浓度低时，质粒重新环化将卓有成效。如果连接反应中浓度有所增高，则在分子内 连接反应发生以前，某一个分子的末端碰到另一分子末端的可能性也有所增大。因此在浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的 寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第、期合刊）从理论上探讨了浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的 比取决于两个参数：j和i。j是分子的一个末端在同一分子

9、的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的呈随机卷 曲。这样，j与分子的长度成反比（因为越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的分子来说是一个常数，与 深度无关。j3/(3lb0)3/2其中l是长度，以cm计，b是随机卷曲的区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而 后者可影响的刚度。i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里o是阿佛伽德罗常数，是 的摩尔浓度（单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的

10、可能性相等。因而在 这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图 1.9显示了区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需浓度之间关系（ugaiczyk等，1985）。 现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组的效率不仅受反 应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源末端的相对浓度的影响。当i是j的倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时） 外源末

11、端浓度的倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40都是由单体质粒与外源所形成的嵌合体。当连接混 合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。涉及带粘端的线状磷酸化质粒的连接反应应包含：）足量的载体，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体为20-60g/ml。）未端浓度等于或稍高于载体的外源，如外源浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。 这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用

12、磷酸酶处理线状质粒或发迹策略以便通过定向的方法构建重组质粒。(二）粘端连接）用适当的限制酶消化质粒和外源。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。）按如下所述设立连接反应混合物：a将0.1l载体转移到无菌微量中，加等摩尔量的外源。b加水至7.5l，于45加温分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到。c加入：10xT4噬菌体连接酶缓冲液 l噬菌体连接酶 0.1Weiss单位mmol/L ATP 1l于16温育小时10xT4噬菌体连接酶缓冲液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50

13、mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500g/ml牛血清白蛋白（组分.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于20。另外，再设立两个对照反应，其中含有（）只有质粒载体；（）只有外源片段。如果外源量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒 ，并尽可能多加外源，同时保持连接反应体积不超过10l。可用至少种不同方法来测定噬菌体连接酶的活性。大多数制造厂商（除 New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，1968)对该酶进行标化。个Weiss单位是指在37下20分钏内催化mmol32P从焦磷酸根 置换到,-32PATP所需酶时，个Weiss单位

14、相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和 Lehman,1970)或者60个粘端单位（如ew England Biolabs公司所定义）。因此，0.015eiss单位的噬菌体连接酶在16下30分钟内可使50的噬菌体Hind片段 （5g）得以连接。在本书中，噬菌体连接酶一律用Weiss单位表示。par 目前提供的噬菌体连接酶均为浓溶液（1-5单位/l），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500g/ml牛血清白蛋白、50甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的噬体 连接酶于-20

15、保存个月可保持稳定。）每个样品各取l转化大肠杆菌。 （三）平端连接噬菌体连接酶不同于大肠杆菌连接酶，它可以催化平端片段的连接（Sgaramella和 Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的 物性，才能使任何分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下个条件：）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。）不存在亚精胺一类的多胺。）极高浓度的连接酶（50Weiss单位ml）。）高浓度的平端。凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大

16、分子群聚作用并可导致分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和 Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT arrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端的总是 迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：）它们可使平端的连接速率加大个数量级，因此可使连接反应在酶浓度不高的条件下进行。）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的浓度下，所有的产物也将是线状多

17、聚体。par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。（）聚乙二醇（PEG8000）用去离子水配制的8000贮存液（40）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和噬菌体连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20进行温育。）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或gCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffe

18、r和Zimmerman,1983）。）浓度为15的PEG 8000可刺激带粘端的分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。）PEG 8000可刺激短至个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。（）氯化六氨合高钴）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为 1.0-1.5mol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的倍 （Rusche和Howard-Flanders,1985）。）在

19、单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状将点尽优势。）与 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。 一、转化由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在1943年，Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎 双球菌后代的转化现象。但DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为， 再与外源DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰