流式细胞仪操作规程_SOP

1、流式细胞仪操作规程目录1:淋巴细胞亚群测定及绝对计数2:活化淋巴细胞亚群、记忆 T及纯真T的检测3: HLA-B27测定4: CD5"CD59测定5:干细胞检测和绝对计数6:白血病免疫分型测定7:淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子 IFN-y/IL-4 测定8:细胞周期分析9:活化血小板检测10:血小板抗体测定11:红细胞抗体测定12:粒细胞抗体测定专业资料.淋巴细胞亚群测定流式细胞仪医院检验科操作规程文件号：200年月一日起实施第1版共3页本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和/或个人院档案室保管者：检验科 主任：检验科 实验室：淋

2、巴细胞亚群测定方法流式细胞仪BeckmanCoulter ,贝克曼库尔特原理：双/三色/四色直接免疫荧光法.荧光素标记的各种单克隆抗体参加到全血中, 与白细胞膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤和固定等步骤后,在流式 细胞仪上进行分析,从而得到淋巴细胞亚群的百分数,参加 Flow-Count即可 得出绝对计数.淋巴细胞外表抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+ B淋巴细胞：CD3-, CDl9+;辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4 +抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8;+ NK细月fi: CD3-CDl6+56将.根据淋巴细胞膜上 C吩子表达的不同,流式细胞 仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群, 利

3、用计算机软件计算出淋巴细胞 亚群的百分数,参加Flow-Count组会自动得出绝对计数.标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态.采集部位静脉采血抗凝剂 EDTA 或肝素抗凝血要求 1 .样本量1ml.2 .样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血的标本不能用.3 .样本白细胞计数应在 4.0-10.0 X10/L之间.假设10.0X109/L ,样本需要稀释,用PBS稀释；假设4.0X109/L,应别离单个核 细胞.品牌贝克曼库尔特成分1 :单克隆抗体剂型液体规格贮存(CD45/4/8/3CD4/8/3CD3/19No.6607013 CD45/56/19/38 CNo.6607

4、073No.IM1650 同型对照 IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672CD19-PC5No.IM26432全血溶血试剂Q-Prep液体(No.7546946)A:甲酸B:碳酸钠等C:多聚甲醛(Optilyse C No.IM1401) 3:鞘液(No.8546859)液体 70ML液体 32ML液体 14ML液体液体 20L4清洗液(No.8546930)液体5L5荧光微球(No.6605359)液体 10ML 2-8No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076Flow-Count 荧光微球 No.7547053)温 室温温温温温 室C (Flow-Check)专业

5、资料.仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1根据要求,分别向已编好号的试管中参加10/20 ul单克隆抗体和同型对照2分别向试管中参加混匀的100u1抗凝血.3混匀,避光,室温孵育20-30分钟4溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血b. 使用COULTER GPRE刚备系统开机一显示READYT亮一选才? 35SECT亮一开门一放入试管 关门一自动进行溶血-显示READY!亮一 开门一取出试管 -再进行下一个样品测定.溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体5上机测样可根据样本情况选择洗或不洗上样6需要做绝对计数的指标,在相应管中参加

6、与血样等量的 Flow-Count务必做 到三同：同枪,同人,同种方法加 Flow-Count,而且加完即上机报告结果报告百分数和绝对值操作性能精密度 批内五次重复CV方参考值(百分数(绝对值)CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072)CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)Th/Ts 1.05-2.03专业资料.临床意义1 .T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标 ,在月中瘤、免疫缺陷、病毒 感染,自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具 有临床诊断、病

7、情判断、治疗等价值.临床常用Th/ Ts比值来判断病人的免疫状况.Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg匕肝等.Th/Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝 和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者.2 : NKffl胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞,所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用.NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、 自身免疫性疾病、 病毒感染、应用免疫抑制剂,疲劳综合征病人等,NK活性随年龄增长而减退.NK细胞也参与第二型超敏反响和移植物抗宿反响,

8、白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加.专业资料.方案(Protocol )1.选参数31 5.| 金 I 二 I：呷中期1 MKF * Edt vw DwE Tod5网知 Athiww HomAGE CytmrtBr Whdw 叱H03 4同回口JffG|j>x|t3 p ii » 二3 feIMQ iCCl.WO NEwF+5X*p ZafcfPfl.O no*xFS*:/F mcriwSSHMt A AcdwRS+5为T.F Mr S5>6 出 1P M F%5tM能 W FeRi 炉E 取F左Hi陶,ArcFacvwfr.pri MKF3cE35ettin 皿 F3

9、CE3FLI 0=1眸山悦flu PHU1lA圈回回图忸吼田|FE1号£ 0 Il rII点击：B PFOTDCOLliFRO 目Ptts田 kd箪 LMPF1Hm向三1 h IB 吉5G | #1 t£ 口 岫*Fte*I23.PP.0 K01,IW 鹏心泠*山 2ao*OTJ=fl.O m*xFS令小P 3t*n 潞睢-*P-JTEwSST5*F M F * |Sttt航安 ADC F比Ri OFCTC 34左hi附, 1Vx F 3c Fki5rt. M*二F比gQi 耳HF%E/SMW *DC r, M3FLI 8 «<FJcE3FlEiM ID q

10、朝jbjOi dObMntG专业资料.口 口 口昌石市1好工 * Cl 1r La 11- r ii罩三由> II - 1_J B随人,匚1|养拈度日上图| m |g zl| .唇|品谆21 ) |可嘲至普XdyWmBT 4Ukri一 厢/诉 一 瓯=而不3s专业资料. 1+1 寓 1I "二r中u7菽Irrppl: TBi jPtp Arutfm nkrnTWdE WvIprX. Wnw htoR* 0 口卓 h 曰 bQb | 1a |-t r g 产上用 | ii合 A '' 工 £ M |却> ri | x |f z h |融 | 造 0

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13、JH.PP.O 回*在 35书汕1.附 四处F玄®24口 可必 FirRl (Fnc.lC W 班a苑 fieMWl'LjAJ世凡 wd阕 InulinFie他tw| 闻§E 酷弼 IhGkxKHFH 口的3Cytenfltw rtrtu?2 站.珞 l(E)qrwtP命名,点击save2.画图专业资料.四FL1 L不T国LOflLi 5flM Phly.L-?产四 FL4LFU 皿专业资料.口皿仰|F1 树 2 Cdcr CQ3 CD1S.LMD . FLl LClQ/FLH L DGr>s止匕图为CD4弱门专业资料.如果做绝对计数,那么-|g|

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16、nt的浓度Chtwrtffe stats* ,】QXF.QZcWrFS SEWsfcr肿华 3ci*wPS-S5>HF 久瞰r S3* 州步 + Efr 635阻+F 4 cci*S HS-H J? 用灯在5加也 arc Fir FLUrn ADC Fa：RJ- rPEh 的C P X flwM WCFirWrfy.aarc F M3 Ft1I AECF3CE3FL2 0PI I If fPl哨小广；* PROTOCOL1 PBi 忆Ptatt Rcktk由Mh.-IMbfiKFJot 1MMm Q.IEJOOMefi*专业资料.选中cell/ul 即可活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的

17、测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter ,贝克曼库尔特)原理：双/三色直接免疫荧光法.荧光素标记的各种单克隆抗体参加到全血中,与白 细胞膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞 仪上进行分析,从而得到相应各亚群的百分数.活化淋巴细胞外表抗原为 CD3+/CD25+ CD3+/HLA-DR + CD3+/CD45RO+记忆型 T 细胞.CD3+/CD45RA 是纯真型T细胞.标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态.采集部位静脉采血抗凝剂 EDTA 或肝素抗凝血要求 1 .样本量1ml.2 .样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血的标本不能用.3

18、.样本白细胞计数应在 4.0-10.0 X10/L之间.假设10.0X109/L ,样本需要稀释,用PBS稀释；假设4.0X109/L,应别离单个核 细胞.品牌剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1 :单克隆抗体液体 28C(CD3/HLA-DR No.IM1295 CD25-PC5 No.IM2646CD3-FITC No.IM1281 CD45RA-PE No.IM18342:全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A:甲酸液体70MLB:碳酸钠等液体32MLC:多聚甲醛液体14ML(Optilyse C No.IM1401)液体3:鞘液(No.8546859)液体20L4:清

19、洗液(No.8546930)液体5L5:荧光微球(No.6605359)液体10ML 2-8CD45RO-PE No.IM1307 CD4-PC5 No.IM2636 )温温温 室室室温温温 室室室C (Flow-Check)专业资料.仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1根据要求,分别向已编好号的试管中参加 10/20 ul单克隆抗体和同型对照2分别向试管中参加混匀的100u1抗凝血.3混匀,避光,室温孵育20-30分钟4溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血b. 使用COULTER GPRE刚备系统开机一显示READYT亮一选才?

20、35SECT亮一开门一放入试管 关门一自动进行溶血-显示READY!亮一 开门一取出试管 -再进行下一个样品测定.溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体5上机测样可根据样本情况选择洗或不洗上样报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV<方参考值百分数CD3+/HLA-DR+ 3.1 ±1.3%CD3+/CD25+ 15.9±3.7%CD3+/CD45RO+ 3.3 ±1.55% CD3+/CD45RA+/CD4+ 20.51 ±3.64%临床意义1 .HLA-DR CD25 CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原,对其进行检测可以判

21、断出疾病的进程,有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗.如活化状态的监测是对 机体移植免疫状况判断的最主要依据,有助于临床选择治疗方案,CD25+/CD3+>5-10%提示排斥、持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR+曾力口 5-10%但不伴CD25增加提示MCM染.2 .正常机体内各种 T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例,如果它 们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱,将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身 免疫病、肿瘤等疾病的发生,检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗.CD45RA CD45RO匀为T细胞的辅助分子, CD45RA纯真型T细胞当免疫力

22、下降时减少； CD45RO+忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感, 通常在急性感染疾病中增加,在慢 性感染疾病中减少.专业资料.方案(Protocol )同淋巴细胞亚群检测结果(Result)HLA-B2制定方法流式细胞仪BeckmanCoulter ,贝克曼库尔特原理：双色直接免疫荧光法.将HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE单克隆抗体参加到全血中, 与白细胞膜上相应的抗体结合,经过溶血、洗涤和固定等步骤后,在流式 细胞仪上进行分析,测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和 所占的百分比.标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态.采集部位静脉采血抗

23、凝剂 EDTA或肝素抗凝血要求 1 .样本量1ml.2 .样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用.3 .样本白细胞计数应在 4.0-10.0 X 109/L之间.假设10.0X109/L ,样本需要稀释,用PBSffi释；假设4.0X109/L,应别离单个核 细胞.4 .溶血样本不能用.品牌贝克曼库尔特成分1 :单克隆抗体剂型 规格 贮存液体 1ML 28CA:甲酸B:碳酸钠等C:多聚甲醛3:鞘液4:清洗液5:荧光微球(HLA-B27/HLA-B72:全血溶血试剂温温温温温室室室室室液体 10ML 2-8 CNO.IM1502同型对照 IgG1/IgG2a No.IM1389 )液体液体

24、 70ML液体 32ML液体 14ML液体 20L液体 5L质控品BEKAMANCOULTERL未开瓶的试剂于2-8 C保存,可在有效期内保 持稳定,稀释的试剂于2-8 C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情 况随时进行校准.专业资料.仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1根据要求,分别向已编好号的试管中参加20 ul单克隆抗体和同型对照IgG2a-FITC /IgG1-PE2分别向试管中参加混匀的100u1抗凝血.3混匀,避光,室温孵育20-30分钟4溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血b. 使用COULTER GPRE刚备系统开机一

25、显示READYT亮一选才? 35SECT亮一开门一放入试管 关门一自动进行溶血-显示READY!亮一 开门一取出试管 -再进行下一个样品测定.溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体5洗、离心、上机测样备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测 报告结果报告阴阳性操作性能精密度批内五次重复CV方参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在 5.0以上,阳 性率90%临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上,该区 DNAt段长度约3000-4000KB, 占人体整个基因的1/3000, HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基 因,与多种疾病具有相关性

26、,尤其是强直性脊柱炎.HLA-B27基因属于？型MHCS因,所有有核细胞上均有表达,尤其是淋巴细胞外表含量丰富,人们发 现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性,超过90%勺强直性脊柱 炎患者HLA-B27抗原表达阳性,而正常人群中仅 5-10%的认为阳性.由于强直 性脊柱炎病症与许多疾病相类似,临床上难以确诊,因此HLA-B27检测在疾病 的诊断中具有重要意义,HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重 要指标.专业资料.方案(Protocol )1.选参数Pte Eft vw Dwert Tod? RS? AthIww EmME CytErter Whdw 叱Of Q

27、 d £2 I J W Lfc |3001塞C|21,|(3|卜厂 F feE _J sdrrii眸山悦flu PHUlOQuwriEH:"工足AIM«Q iCCl.WO WraiCTfE图尸 wEctMQ 1EwFSTS"*F mcriwSSTS:*P WidwFMS.F cid« 告缶注* M*二F比忸M/ fl£< FJc Rl OFfrC IKF乐FU网 ftM.FEcrfcw-Mt. HKF3cVWt.fi WX：F3cE35etHn 皿 F3cE?RJ 的一 Ia 11,n串工团31 bl 吉修皿二电唔省白dzl&#

28、163; 口岫*FteAiflk Secup | Mux出 | DMptfiuAan |9 iri=iH=Slut123.0ZociwJPfl.D 3(riwF5KftF aaAuS-Afi4 EwSSTSsHF AEC F Sc ISdWqs AECFRI (RTf 丽仃左血炉tp M F 双 Flow-SSi AD二F 2Kk加四 3F阳闰协 肛町FNE3H I的 AT"ZF3cE3Fl2i)5l ( aHEI 口<<*!*<A过 4专业资料.、工-园田m一回国田TJr w加M 0- = 一4 -二1Wl>mFreflrvw -31" >3

29、«? &1西H A/匚-瑞胜SWSPSKfHB- lmqkl看-unoud 娶母：* £l&rl日 HF*»口手 翠mEBLdI?匚nf里=一R* f-99-a- m$isF醺E E-Kc- ULtLlx£口 : 上万 n一 ：二- 、*9>'0 二一,- 一 伊IfelaA ,二尊葩|¥沿/向|±:记卢 3鼻-口手¥ -u百1 F1 "1用题£1 -I七芍1 1互7L邑区LL包-ttl,IXF5 E SEEFnrlLB-I -E?FJbH罟f3 mw5手ls寓-a-e4tw

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31、TI,宜*£7*.*2四&«后:4MN 稼贴*Ld d-1可臼±1*1Jffil 翻".键入文件名,点击 Save2.画图网 FL1 LwIlVqMiH 监 Liivf UnW1H32M国 FLi l5LE LWHL* 审 FFMLtHJTFrTC专业资料.结果1. positive (+)F lMUngaied) 1S71M0 : £S/F4X-Mean=17.12. negative(-)|F1)A 13B.LMO : FL1 LDG/FL2 LDGIF1JA 13d .L MO ： FL1 LDGfFLZ LDE32X-Mean=

32、1.2X-Mean=5.8专业资料.CD55/CD5测定方法流式细胞仪BeckmanCoulter ,贝克曼库尔特原理:双色直接免疫荧光法.近年的研究说明,红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义.血细胞红细胞和白细胞通过膜上的抗原分子与荧光素标记的 CD5瞰CD59勺多克隆 抗体结合.用流式细胞仪检测CD55或CD5眼达阳性细胞百分数.标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态.采集部位静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血要求 1 .样本量1ml.2 .样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用3 .溶血样本不能用.品牌

33、剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1 :单克隆抗体 液体 1ML 2-8CNO.IM2726)2全血溶血试剂液体A:甲酸液体 70MLB:碳酸钠等液体 32MLC:多聚甲醛液体 14ML3 :鞘液液体 20L4清洗液液体 5L5荧光微球液体 10ML(CD59-FITC No.IM3457 CD55-PE2-8 C温温温 室室室室室质控品BEKAMANCOULTERL未开瓶的试剂于2-8 C保存,可在有效期内保 持稳定,稀释的试剂于2-8 C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情 况随时进行校准.专业资料.仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：一白细胞C

34、D55/CD5瞄测1 .准备2支流式细胞仪专用管,分别标记.分别向二管中参加样品100ul.2 .溶血：a. OptiLyse C 按说明书步骤溶血b. 使用COULTER GPRE刚备系统开机-显示READYT亮-选才? 35SECT亮-开门-放入试管 关门-自动进行溶血-显示READY!亮-开门-取出试管 -再进行下一个样品测定.*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体3 .离心后分别参加 CD55/CD5910U1和相应的同型对照10ul.避光20-30分钟.4 .洗涤离心5 .上机测样二红细胞CD5'CD5瞄测1 .准备2支流式细胞仪专用管,分别标记2 .分别参加CD55/C

35、D59 10ul和相应的同型对照10ul.3 .向二管中参加1: 200稀释的样品100ul 可根据红细胞的数量调整,避 光20-30分钟.4 .洗涤离心.5 .混匀、上机测样.报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV<方参考值CD55>97%CD59>97%PNH 的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90%PNH 的诊断值：RBC CD59>91% 大局部>80% 中性粒细胞CD59>84%临床意义用于AA和PNHB诊断和分型诊断.PNH寸CD55ffi CD5那么显减低和缺如专业资料.方案(Protocol )(同

36、HLA-B27)UtiovlAd SS LinTFS UnCg+FfTCCD59-FITCC 口 55,牌9112»3)41心专业资料.结果1.RBC: normal|F1|Uh0tf1»dl RPBcdMM LMD : FlffT! Llnn=S Un(FME PPfcdSi® L MD : PMT2Leg|F 1|E| fiPBed5539 LmO PMT3 g2.RBC: abnormalMW型n Phm LCfliFS 5"I 1 1 llll| 111*1iCT*|对 ifl1S5 Loq专业资料.3192电叫H,.%|A FirfTi Lc.

37、g.iF'MTn Leg840J6%专业资料.干细胞检测和绝对计数方法流式细胞仪(BeckmanCoulter ,贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法.荧光素标记的各种单克隆抗体参加到全血中,与干细胞 膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上 进行分析,从而得到百分数,参加 Flow-Count即可得出绝对计数.标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态.采集部位静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血要求 1 .样本量1ml.2 .样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血的标本不能用.3 .样本白细胞计数应在 4.0-10.0 X109/L之间.假

38、设10.0X109/L ,样本需要稀释,用PBS稀释；假设4.0X109/L,应别离单个核 细胞.品牌贝克曼库尔特成分1 :单克隆抗体剂型规格贮存液体 2 8 C2:全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A:甲酸液体70MLB:碳酸钠等液体32MLC:多聚甲醛液体14ML(Optilyse C No.IM1401)液体3:鞘液(No.8546859)液体20L4:清洗液(No.8546930)液体5L5:荧光微球(No.6605359)液体10ML 2-8(CD34 No. IM1871Flow-Count荧光微球CD45-PCWO.IM2653/IM2652No.75470

39、53)温 室温温温 室室室温温 室室C (Flow-Check)专业资料.仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1根据要求,分别向已编好号的试管中参加 10 ul单克隆抗体和同型对照2分别向试管中参加混匀的100u1抗凝血.3混匀,避光,室温孵育20-30分钟4溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血b. 使用COULTER GPRE刚备系统开机一显示READYT亮一选才? 35SECT亮一开门一放入试管 关门一自动进行溶血-显示READY!亮一 开门一取出试管 -再进行下一个样品测定.溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体5需要做绝对计

40、数时,在相应管中参加与血样等量的 Flow-Count务必做到三 同：同枪,同人,同种方法加 Flow-Count,而且加完即上机6上机测样报告结果报告百分数和绝对值操作性能精密度批内五次重复CV方参考值百分数绝对值CD34+/CD45+ 0.58 ±0.29%临床意义目前把CD34作为造血干细胞的主要标志,CD34阳性细胞计数作为造血干 细胞水平定量的检测方法.专业资料.方案(Protocol )同淋巴细胞亚群检测网I PMT3 LogfPiMTI Lin结果(Result)ILhqsiedl RHq UnfS Lin白血病免疫分型测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter

41、,贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法.荧光素标记的各种单克隆抗体参加到全血中,与细胞膜 上或膜内相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞 仪上进行分析,从而得到百分数.标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态.采集部位骨髓采血抗凝剂 EDTA 或肝素抗凝要求 1 .样本量1ml.2 .样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血的标本不能用.3 .样本白细胞计数应在 4.0-10.0 X109/L之间.假设10.0X109/L ,样本需要稀释,用PBS稀释；假设4.0X109/L,应别离单个核 细胞.品牌贝克曼库尔特成分1 :单克隆抗体剂型规格贮存液体 2 8

42、C2:全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A:甲酸液体70MLB:碳酸钠等液体32MLC:多聚甲醛液体14ML(Optilyse C No.IM1401)液体3:鞘液(No.8546859)液体20L4:清洗液(No.8546930)液体5L5:荧光微球(No.6605359)液体10ML 2-8(CD34 No. IM1871Flow-Count荧光微球CD45-PCWO.IM2653/IM2652No.7547053)温温 室室温温温温C (Flow-Check)专业资料.仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作-样本制备：细胞膜外

43、表抗原1 .首先准备所需的管,并在管上标记上欲参加的抗体.2 .首先每管中参加5ul CD45-PC5抗体.3 .然后,按管上的标记,参加相应抗体各10ul注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配4 .各管中参加标本骨髓或外周血30100u1根据细胞的多少决定,振荡混 匀,室温避光2030分钟.5 .溶血：a. OptiLyse C 按说明书步骤溶血b. 使用COULTER GPRE刚备系统开机-显示READYT亮-选才? 35SECT亮-开门-放入试管 关门-自动进行溶血-显示READY!亮-开门-取出试管 -再进行下一个样品测定.溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体细胞浆和核抗原1 .

44、准备所需的管,并在管上标记上欲参加的抗体,其中一管是同型对照.2 .首先每管中参加标本骨髓或外周血100ul根据细胞的多少决定 ,5ulCD45-PC5抗体.室温避光20分钟.3 .每管中参加固定液100ul,剧烈振荡混匀,室温避光15分钟.4,各管中参加PBS4ml5 . 300g离心5分钟后,弃去上清液,振荡混匀.1500r/min*5min6 .各管中参加透膜剂100ul ,轻轻混匀,室温避光5分钟.7 .加抗体,阴性对照管中参加10ul,其余各管参加相应抗体各10ul ,室温避 光15分钟.8 .各管中参加4mlPBS振荡混匀.9 . 300g离心5分钟后,弃去上清液.10 .各管中参

45、加PBS500ul,振荡混匀.11 .上机测样报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV方参考值CD34+<5%MPO+<5%粒系<20% 淋系<30%专业资料.临床意义用于血液病的诊断和分型诊断方案(Protocol )T细胞亚群细胞内因子IFN-y/IL-4检测方法流式细胞仪BeckmanCoulter ,贝克曼库尔特原理：直接免疫荧光法.肝素钠抗凝全血在PMA lonomycin和Monensin存在下短期 培养辅助性T细胞通过细胞因子IFN-丫、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚 群.淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子,且迅速分泌到细胞外.因此,利用刺 激

46、剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞,然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外,使细胞因子在细胞内滞留到一定的量,然后进行细胞膜外表抗原和细胞内细胞因子染色,使用流式细胞仪对CD4+ffl胞内的IFN- 丫和IL-4进行测定.本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态.采集部位静脉采血抗凝剂肝素抗凝血要求 1 .样本量至少1ml.2 .样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用.3 .样本白细胞计数应在4.0-10.0 X 109/L之间.假设10.0X109/L ,样本需要稀释,用PBSffi释；假设4.0X109/L,应别离单个核 细胞.4 .溶血样

47、本不能用.试齐I淋巴细胞培养体系自配成分：刺激素PMA离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液. 选白美国SIGM怂司.单克隆抗体BeckmanCoulter公司CD4-PC5No.IM2636、IL-4-PENo.IM2719、IFN- 丫-FITCNo.IM2716.质控品BEKAMANCOULTER6,未开瓶的试剂于2-8 C保存,可在有效期内保 持稳定,稀释的试剂于2-8 C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情 况随时进行校准.专业资料.仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作：工田胞培养与染色取200ul抗凝血参加lOul CD4-PC邪抗,室温避

48、光孵育30分钟,RPMIl640 洗涤一次,将细胞参加培养体系中,5%CQ 37 c孵育18小时,取出后以PBS M一次.用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜.将细胞分成两管,其一 为测定管参加lOul抗人IL-4-PE和IFN-y-FITC,另一管参加同型对照,室温 避光20分钟,PBSgfc涤一次,待测.,式细胞仪测定翻开流式细胞仪及氮激光光源488nm预热20min,同时仪器自动初始化； 用标准荧光微球校正光路和流路,然后依次检测标本,每份标本检测50000以上细胞,在前向散射光FS和测向散射光SSC散点图中圈定淋巴细胞群,然 后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN- 丫 -FITC的表达.淋巴细胞在FS/SSC散点图中位置,即A门内细胞； A门内CD4m性细月的,即B门内细胞； B门内TH细胞亚群分布：1区数值-Th 1细胞(%)4区数值-Th 2细胞(%)2区数值-Th 0细胞(%)报