SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量

1、0000实验教学教案首页本次实验项目：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量本次实验课时：8学时实验类型：设计性教学要求:1 .用SDS- PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量；2 .熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。3 .够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，如标准蛋白质的选择、分离胶与 浓缩胶浓度的确定与制备、灌胶、样品的处理、上样量及方法的选择、电泳时电压 的控制、染色与脱色时间的确定、并能够对电泳过程中出现的问题加能解决，能够 独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。重 点：实验原理、整个实验过程的设计与操作，如标准蛋白质的选择、分离胶与浓缩胶浓度

2、的 确定与制备、灌胶、样品的处理、上样量及方法的选择。教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。讲授内容及时间分配: 课堂讲授1 .相关知识 0.1 学时2 .实验目的 0.3学时3 .实验原理 0.3学时4 .实验操作 0.3 学时实验教学SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量实验的操作技术7学时参考资料生物化学实验SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量（设计性）相关知识1 .电泳？2.影响电泳速率的因素？3.SDS的作用？ 4. 3 乙醇的作用?2 .聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）:丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺TEMED过硫酸俊聚丙烯酰胺凝胶3 .分类：自然胶电泳、变性胶电泳

3、、等电聚焦电泳、梯度胶电泳、双向电泳、印迹转移电泳。4 .不连续缓冲系统：SDS-PAGE电泳体系为不连续电泳体系。5 .分离胶浓度的选择和配制方法SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围蛋白质相对分子质量范围分离胶的浓度V 10420% 30%1X104 4X10415% 20%4X104 1X10510% 15%1X105 5X1055% 10%>5X 1052% 5%*双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为1 : 29。常用的标准蛋白质的 Mr蛋白质名称Mr (D)蛋白质名称Mr (D)牛血清清蛋白66200牛胰凝乳蛋白酶原25000鸡卵清蛋白43000溶菌酶14300猪甲状腺球蛋白669000猪胃

4、蛋白酶35000马心细胞色素c12500马肺铁蛋白440000牛肝过氧化氢酶232000牛心乳酸脱氢酶140000兔磷酸化酶B97400兔肌动蛋白43000胰蛋白酶抑制剂20100牛碳酸酎酶31000不同分离胶的配制方法分离胶的浓度20%!5%12%10%7.5%重烝水0.752.353.354.054.851.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml2.52.52.52.52.5质量浓度为10%SDS/ml0.10.10.10.10.1凝胶贮备液（Acr/Bis）/ml6.65.04.03.32.5质量浓度为10% AP/ul8 08 08 08 08 0TEMED/ ul6666

5、6总体积/ml10101010105%浓缩胶的配制方法重烝水2.920.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)/ml1.25质量浓度为10%SDS/ml0.05凝胶贮备液（Acr/Bis）/ml0.8质量浓度为10% AP/ul40TEMED/ ul6总体积/ml5注意：根据实验目的、实验要求、实验条件在实验前写出实验设计方案一、 实验目的、实验要求、实验条件 实验目的1 .用SDS- PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量；2 .熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。实验要求1 .能够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，注意几个设计点：如标准蛋白质的选择依据；分离胶的确定与制

6、备：浓度大小的依据是？分离胶配制量多少 的依据是？灌胶方法的选择？上样量的确定：依据蛋白质浓度大小确定上样量，一般是样 品在含16种蛋白且各占比例相当的情况下浓度在12mg/ml时、对凝胶大小在 8X 8.2时，上样量为1020ul;电泳时电压控制多大的选择；能够对实验过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。2 .利用标准曲线计算出待测蛋白质样品的Mr。实验条件1 .实验所需的实验试剂和材料。2 .实验所需的主要实验仪器。二、实验原理带电颗粒在单位电场中泳动的速度称为迁移率或泳动度（mobility）。泳动度与带电颗粒所带静电荷的数量、颗粒大小和形状有关

7、。一般来说，颗粒所带静电荷的数量越多，颗粒越小，越接近球 形，则泳动度越大。SDS即十二烷基硫酸钠（sodium dodycyl sulfate）,是一种阴离子去污剂。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，能使 不同种类蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质原有电荷的差异。在 蛋白质溶解液中，加入 SDS和疏基乙醇，由于疏基乙醇具有还原性，因此可使蛋白质分子中的二硫 键还原，从而使具有四级结构白蛋白质分成单个亚基（subunit）; SDS则可使蛋白质的氢键、疏水键打开，引起蛋白质构象的变化，形成近似雪茄形的长椭圆棒状蛋白

8、质-SDS复合物，不同种类蛋白质的蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约为 1.8nm,而长轴则与蛋白质的Mr成正比。这样，不同种类蛋白质的蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的泳动度不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度，也就是蛋白质的Mr有关。蛋白质的 Mr越大，迁移率越小。研究表明，在一定的条件下，蛋白质 Mr的对数（lgMr）与其Rf成负相关。在测定未知蛋白质的Mr时，可选用一组合适的标准蛋白以及适宜的凝胶浓度，与待测蛋白质样品同时进行SDS-PAGE,然后根据已知 Mr蛋白质的电泳迁移率与其 Mr的对数（lgMr）作出标准曲线，最后根据未知Mr蛋白质的电泳迁移率求得其Mr。单体

9、丙烯酰胺（acylamide , Acr）和交联剂 N, N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide , Bis）在加速剂和催化剂的作用下可以聚合联结成具有三维网状结构的凝胶。常用的催化剂为过硫酸 镂（AP）,加速剂为四甲基乙二胺（TEMED）。用途：亚基分子量测定、变性蛋白的分离。蛋白质纯化过程中的质量控制。三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器：垂直板电泳槽；电泳仪；微量进液器等 （二）实验材料1 .自提取或市售蛋白质（酶，含量在 2mg/ml）样品3种（1号，2号，3号）2 .标准相对分子质量（中）的蛋白质：内含已知相对分子质量的5种蛋白（各占比例相当的情况下浓度在1

10、2mg/ml）（三）实验试剂1 . 30%丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺29.2g, N, N-甲叉双丙烯酰胺 0.8g,加drO至100ml。装于棕色瓶中，置 4c冰箱保存，30天内使用。丙烯酰胺和 N, N'-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于 溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29% （w/v）丙烯酰胺和1% （w/v） N, N'-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光 催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性

11、并容易吸附于皮肤。2 .分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl缓冲?夜,pH8.818.15gTris （三羟甲基氨基甲烷），加约80ml重蒸水，用1mol/LHCl调pH到8.8,用重蒸水稀释 至最终体积为100ml,置4c冰箱保存。3 .浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl缓冲?夜,pH 6.86gTris,加约60ml重蒸水，用1mol/L HCl调pH到6.8,用重蒸水稀释至最终体积为100ml, 4 C冰箱保存。4 .十二烷基硫酸钠（SDS）: SDS可用去离子水配成 10% （w/v）贮存液保存于室温。5 . TEMED（N,N,N' ,N-四甲基乙二

12、胺）：市售溶液。TEMED通过催化过硫酸镂形成自由基而加速丙 烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。6 . 10% （w/v）过硫酸镂（w/v）:提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基。须新鲜配制。7 . Tris-甘氨酸电极缓冲液：0.025mol/L Tris , 0.192mol/L 甘氨酸，0.1%SDS, pH8.3。8 . 2倍还原样品缓冲液（2 x reducing buffer）：总体积10ml2.5ml2.0ml0.5mol/L Tris-HCl(pH 6.8)甘油4.0ml0.5ml1.0ml10% SDS0.1%澳酚蓝3 -疏基乙醇9 .染色液：称取 1g考马斯亮蓝 R250,

13、溶于250ml甲醇，再加入 100ml冰乙酸，用dH2O定容至 1000ml。10 .脱色液：取 250ml甲醇、100ml冰乙酸用dHzO定容至1000ml。四、实验操作步骤 （每67人共做一个胶板，可进行步骤分工合作，每人上一个样）1 .凝胶模的准备：清洗干净，用纱布擦干。压好胶条，固定好。2 .制备分离胶：，每个胶板配制 5ml,根据标准相对分子量蛋白和待测蛋白样品在一小烧杯中配制 一定浓度（设计）一定体积的分离胶（每板配制5ml）。最后一切准备好后再加入 AP。问题：为什么一切准备好后再加入AP?注意移液器的使用方法？3 .灌注分离胶：迅速在两玻璃板的间隙中灌注，留出灌注浓缩胶所需空间

14、（梳子的齿长再加0.5cm）。再在胶液面上小心注入一层水（约23mm高）。聚合约30分钟，倾出覆盖水层，再用滤纸条吸净残留水。问题：在胶液面上小心注入一层水？4 .制备5%浓缩胶：每个胶板制备 2.5ml。最后一切准备好后再加入 AP。5 .灌注浓缩胶：在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，将凝胶垂直放置于室温下。聚合约 30分钟。6 .小心移出梳子。去掉胶条，把凝胶板固定于电泳装置上，低面向内。7 .内外槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 问题：为什么设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡8 .待测样品的处理

15、：待测样品首先要测定蛋白质浓度（2mg/ml,本实验已知），取一定量样品中按1:1体积比加入2倍还原样品缓冲液，在 100c加热3分钟。样品处理集体处理，共用。问题：为什么用 2倍还原样品缓冲液处理样品？100c加热3分钟的作用？9 .上样：每板10个泳道，每组按予定设计的加样顺序上样，每人设计好上样量（从3种待测样品中选择1种），每个凝胶板留一个泳道上标准蛋白质。注：上样速度要快，不要串道。待测样品蛋白质浓度在2mg/ml, 一般上样量1020 ul10 .将电泳装置与电源相接，稳压 80V,当染料前沿进入分离胶后，调到120 V。继续电泳直至澳酚蓝到达分离胶底部上方约1cm,然后关闭电源。问题：2倍还原样品缓冲液中澳酚蓝的作用？11 .从电泳装置上卸下玻璃板，取下凝胶：用刮勺撬开玻璃板。小心取出凝胶。12 .染色与脱色：凝胶进行染色 30分钟，脱色其间更换数次脱色液