试验一-DNA提取

1、实验一-DNA提取实验一 DNA 的小量制备小量法提取植物基因组 DNACTAB 法1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速开展及广泛应用,人们经常需要提取高分子量的植物 DNA,用于构建基因文库、 基因组 southern 分析、 酶切及克隆等,这是研究基因结构和功能的重要步骤.本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握 CTAB提取 DNA 的方法,进一步了解 DNA 的性质.2 实验原理细胞中的 DNA 绝大多数以 DNA-蛋白复合物DNP的形式存在于细胞核内.提取 DNA时,一般先破碎细胞释放出 DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质,最后用乙醇把 DNA从抽提

2、液中沉淀出来.DNP 与核糖核蛋白RNP在不同浓度的电解质溶液中溶解度差异很大,利用这一特性可将二者别离.以 NaCl 溶液为例：RNP 在 0.14mol/LNaCl 中溶解度很大,而 DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的 1%.当 NaCl 浓度逐渐增大时,RNP 的溶解度变化不大,而DNP的溶解那么随之不断增加.当NaCl浓度大于1mol/L时,DNP的溶解度最大,为纯水中溶解度的 2 倍,因此通常可用 1.4mol/LNaCl 提取 DNA.为了得到纯的 DNA 制品,可用适量的RNase 处理提取液,以降解 DNA 中搀杂的 RNA.关于植物总 DNA 的提取主要有两种方法：1.CTA

3、B 法：CTAB十六烷基三甲基澳化俊,hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称 CTAB:是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中0.7mol/LNaCl是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度0.3mol/LNaCl时从溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白、 多糖类物质分开,然后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再参加乙醇使核酸沉淀,CTAB 能溶解于乙醇中.2.SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS 十二烷基磺酸钠,Sodiumdodecylsulfate,简称 SDS使 DNA 与蛋白质

4、别离,在高温5565C条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提升盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的 DNA 用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA.一般生物体的基因组DNA为107109bp,在基因克隆工作中,通常要求制备的大分子 DNA 的分子量为克隆片段长度的 4 倍以上,否那么会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,严重影响克隆工作.因此有效制备大分子 DNA 的方法必须考虑两个原那么：1尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质如多酚、类黄酮等、多糖等杂质,并预防和抑制内源

5、 DNase 对 DNA 的降解.2尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏.几乎所有的 DNase 都需要 Mg2+或 Mn2+为辅因子,故实现1尽量去除蛋白质的要求,需参加一定浓度的螯合剂,如 EDTA、柠檬酸,而且整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴).为实现(2)需要在 DNA 处于溶解状态时,尽量减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行 DNA 溶液转移时用大口(或剪口)吸管.提取的 DNA 是否为纯洁、双链、高分子的化合物,一般要通过紫外吸收、化学测定、熔点(meltingtemperature,Tm)测定、电镜观察及电泳别离等方法鉴定.本实验采用 CTAB 法提取 D

6、NA 并通过紫外吸收法鉴定.3 材料和试剂：3.1 长春花叶片3.2 试剂(1)CTAB 提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA-Na2,1.4mol/LNaCl(如表 1),2%CTAB,使用前参加 0.1%(V/V)的,琉基乙醇.表 1CTAB 提取缓冲液配制试剂名就M.W.配制 1000mL配制 500mLTas1211412114 反60%EDTA-吗372.247.-H48e土 72Mg&N5caSESE444481.816g用 HCl 调 pH 值.(2)TE 缓冲液：10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA(pH8.

7、0).(3)氯仿/异戊醇：将氯仿和异戊醇按体积 24:1 的比例混匀,置棕色瓶中,4c 保存.4 仪器设备离心机、3 离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等.5 方法与步骤：5.1 在提取过程中用到的吸头,提取缓冲液等先高压灭菌(121C,20min),取出后待用；5.2 取大约指甲盖大小的植物叶片,放入1.5ml的EP管中,参加液氮,用钢珠研磨成粉末状,再参加 600 人的 CTAB 提取缓冲液,；5.3 65c 水浴锅中水浴 40min,参加等体积的氯仿：异戊醇(24:1),轻轻混匀,颠倒几次,乳化 1min.4C,11,

8、000rpm 离心 10min；5.4 吸上清到新离心管中(约 400l),参加等体积预冷异丙醇,混匀,-20C 放置 20min沉淀 DNA;5.5 5000rpm 常温离心 15min,倒掉上清液；5.6 用 75%乙醇(900Nl)洗沉淀,11,000rpm 离心 2min,倒掉乙醇,再用乙醇同样处理一次；5.7 置于枯燥仪枯燥 10min,将水分蒸干；5.8 参加 50 人去离子水,融解 DNA,同时参加 RNA 酶(按每 50 人 DNA 参加 1 山RNase),37c30min；5.9 利用分光光度计检测 OD260,同时进行 1%凝胶电泳检测；5.10 琼脂糖电泳检测 DNA:

9、制作 1%的琼脂糖凝胶,吸取提取的 DNA 溶液 5 小电泳检测；5.11 -20C 保存 DNA 备用；5.12 提取的 DNA 的浓度检测：取少量待测 DNA 样品,用蒸储水稀释 1,000 音；用蒸储水做空白,分别在 260nm、280nm 测 DNA 样品的吸光值.【考前须知】1 .叶片磨得越细越好.2 .注意移液器的正确使用.3 .由于植物细胞中含有大量的 DNA 酶,因此,除在抽提液中参加 EDTA 抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出 DNA 酶,使 DNA 降解.6 .思考题1.制备的DNA在什么溶液中较稳定？2 .为了保证植物DNA的完整性,

10、在吸取样品、抽提过程中应注意什么？7 实验结果：结果计算DNADNA浓度(PgniLgniL)=)=一稀样倍数0.020L0.020L式中OD260nm为260nm处的光密度；L为比色杯光径(cm);0.020为1itg/mLDNA钠盐的光密DNA的紫外吸收顶峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的紫外吸收顶峰为280nm.上述DNA溶液适当稀释后,在751分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm和OD280nm.如OD260nm/OD230nrr2OD260nm/OD280nrr1.8,表示RNA已经除净,蛋白含量不超过0.38 实验分析:传统DNA1取方法CTAB 法、SD

11、S 法是在裂解细胞的根底上,屡次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保存在水相,到达别离核酸的目的； 参加 RNA 酶除去核酸中的 RNA;然后参加异丙醇、乙醇等沉淀 DNA;用 70%乙醇漂洗沉淀,除去别离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反响,最后用 TE 溶解 DNA 备用.CTAB是一种阳离子去污齐1J,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐(0.7mol/L)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.10.5mol/LNaCl)下 CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大局部的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中.通过有机溶剂抽提,去除蛋白

12、、多糖、酚类等杂质后参加乙醇沉淀即可使核酸别离出来.经离心弃上清后,CTAB-核酸复合物再用70%酒精浸泡可洗脱掉CTAB.SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温(5565C)条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时 SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸；提升盐(KAc 或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使 SDS-蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀；上清液中的 DNA 用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNAoSDS 法操作简单,温和也可提取到高分子量的 DNA,但所得到的产物含糖类杂质较多.基因组 DNA 经典

13、的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的 DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为 DNA 提取的常规方法.但这种方法操作步骤复杂耗时长,易交叉污染,残留在 DNA 溶液中有机物质对 DNA 聚合酶有抑制作用.另外,酚、 氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康.DNA 提取新方法近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等根底 DNA 提取新方法.这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA.已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA的报道.马小军等将CTAB液提取和氯仿抽提两步的上

14、清液直接通过 Wizard 纯化系统纯化得到的 DNA,RAPD 扩增效果良好,产率达2250ggg.张博等用硅珠(SiO2)颗粒吸附 DNA 纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的 DNA 样品.黄椰林等对常规 CTAB 法提取的 DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获 DN 的 APCR 产物能直接测序比拟适用于富含黏多糖、单宁、多酚和菇类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料.袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯洁的总 DNA.目前国内外开发了多种商品化的 DNA 提取纯化试剂盒,具别离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与 DNA 结合到达别离、回收的

15、目的,如离子交换柱、磁珠等.这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效,DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少.著名的国外的试剂盒生产厂家有 Sigma2Aldrich、 Promega、 Invitrogen、 TaKaRa、 Whatman等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒.国内的生物公司开展迅速,如上海生工、北京大为、北京博奥等也开发了系列试剂盒,质量与国外厂家相当,价格较低.除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择.DNA 试剂盒经过了几十年的开展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了 DNA 提取一扩增 PCR 试剂盒,将 DNA 提取和 PCR 扩增结合起来,极大的提升了工作效