p16和Rb在宫颈上皮内瘤样变及癌中的表达

1、p16和Rb在宫颈上皮内瘤样变及癌中的表达 作者：王冰徐长福王晓丽莫立平李明众 【关键词】 宫颈癌 关键词: p16基因;Rb基因;宫颈上皮内瘤样病变;宫颈癌;免疫组化 摘 要:目的 探讨p16和Rb基因产物在宫颈癌中的表达，及与临床病理参数间的关系. 方法 应用免疫组化技术（SP法），检测p16，Rb基因在10例正常宫颈组织、10例宫颈上皮内瘤样变（CIN）及59例宫颈鳞癌中的表达. 结果 20%CIN（2/10）和29%宫颈鳞癌（17/59）中，p16免疫反应阴性.p16蛋白表达缺失在不同年龄间有显著差异，而在肿瘤生长类型、临床分期及组织学分级各组间比较无显著差异.宫颈癌中Rb表达阳性率为

2、88%（52/59），随组织学分级增高，Rb蛋白表达率升高，各组间比较有显著差异.66%的宫颈癌两种蛋白共表达阳性. 结论 p16失活参与部分宫颈癌的发生.Rb可能主要通过功能性失活参与宫颈癌的发生. Keywords:p16gene;Rb gene;cervical intraepithelial neo-plasias; cervical carcimoma; immunohis-tochemistry Abstract:AIM To study the expression of p16and Rb in cervical carcinoma and its relationship w

3、ith clinicopathologic features.METHODS Using SP immunohistochemical tech-nique，we examined the expression of p16and Rb in10nor-mal cervical tissues，10cervical intraepithelial neoplasias and59invasive squamous cell carcinomas.RESULTS 20%CIN（2/10）and29%cervical carcinomas（17/59）showed nega-tive p16sta

4、ining.Abnormal p16expression was related to age of patients.There were no statistically significant differ-ences in the p16status with respect to gross type，histologic differentiation and stage of the disease.Rb was expressed in52of59（88%）cases of cervical carcinomas.Rb expression was significantly

5、correlated with histologic differentiation（P<0.005）.66%of specimens was immunoreactive for both Rb and p16.CONCLUSION Inactivation of p16may play an important role in the genesis of human cervical carcinoma.Rb may be functionally inactivated in cervical cancer. 0 引言 细胞周期调节失控与细胞癌变密切相关1 .在细胞周期进

6、程中关键限速点G1 -S期的过度依赖于Rb蛋白的磷酸化，cyclin D1与细胞周期蛋白依赖性激酶（cdk4）结合并激活后者，使Rb蛋白磷酸化失活，促进细胞完成G1 -S期过渡从而进入增殖状态1 .这一过程可通过p16蛋白与cdk4竞争性结合而受到抑制.此细胞周期调节通路中p16，cdk4，cyclin D1和Rb基因产物的异常表达在许多人类肿瘤中存在.我们着重探讨p16，Rb蛋白在宫颈癌中异常表达的频率及与临床病理参数间的相关性. 1 材料和方法 1.1 材料 我院1997/1999手术切除和门诊活检宫颈组织材料79例，取材后常规甲醛液固定，石蜡包埋，连续切片3张，1张行HE染色复诊.其中正

7、常宫颈组织10例，上皮内瘤样变10例，宫颈鳞癌59例.年龄2970（平均51）岁.FIGO临床分期:B期8例，A期1例，B期43例.病理分级按WHO方法:级7例，级24例，级28例.临床大体分型:菜花型30例，结节型18例，溃疡型3例，混合型1例（7例缺少年龄、临床分期、大体分型原始资料）. 1.2 方法 采用SP免疫组织化学方法，p16，Rb兔抗人多克隆抗体为Santa cruz公司产品，SP试剂盒为Zymed公司产品、一抗稀释度为130.实验步骤按试剂盒说明书进行.将已知阳性的食管癌切片作为阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照.凡染色强度明显高于背景者为阳性表达，将阳性细胞按其数量

8、及染色强度分为3级:表达弱阳性（+），即阳性细胞数小于10%，染色强度为弱阳性或仅个别细胞呈中至强阳性;表达强阳性（），即阳性细胞数为60%以上，染色强度为中至强阳性，少数细胞可为弱阳性表达;中度阳性（），即阳性细胞数介于表达弱阳性与表达强阳性两级之间;染色强度与背景无明显差别者为阴性. 统计学处理:2 检验，Spearman等级相关及Fishers精确概率法检验标准取（P<0.05）为显著性差异. 2 结果 2.1 p16及Rb的表达 p16定位于胞核和胞质内，为粗细不一的棕黄色颗粒（Fig1）.正常宫颈上皮中阳性细胞主要分布在基底层和棘细胞层，浸润癌中p16阳性细胞呈弥漫或散

9、在分布.10例CIN中2例p16蛋白表达缺失，59例宫颈浸润性鳞癌中，17例p16蛋白表达阴性，占29%，两者之间无统计学差异（P>0.05）.Rb的免疫反应产物主要定位于胞核内（Fig1）.59例浸润癌中，7例Rb蛋白阴性表达，占12%，17例弱阳性（+），35例阳性（）. 图1 略 表1 宫颈癌中p16蛋白阴性表达与临床病理参数间的关系略 2.2 p16及Rb表达与临床病理的关系 50岁以下年龄组p16阴性表达占42%（10/24），而50岁以上组为14%（4/28），两组之间有明显差异（P<0.05）. p16蛋白表达在肿瘤生长类型、临床分期及组织学分级各组间

10、无明显差异（P>0.05，Tab1）.Rb蛋白表达在组织学分级各组间差异显著（P<0.05），组织学级中Rb强阳性11例，占总强阳性表达的61%.在其他病理参数各组间比较无明显差异（P>0.05，Tab2）. 表2 Rb蛋白表达与组织学分级的关系略 2.3 p16与Rb基因表达关系 宫颈鳞癌中p16与Rb基因表达之间无负相关关系（r=0.143，P=0.176）.59例宫颈鳞癌中39例两种蛋白共表达阳性（66%），4例存在两种基因同时表达缺失（7%）. 3 讨论 p16是抑制肿瘤生长的关键成分2，3 .在p16基因存在纯合缺失、甲基化时，免疫组化p16

11、染色为阴性4 .实验中p16蛋白定位于胞核和胞质，胞质内p16蛋白可能是以不同于核内p16蛋白的功能状态而存在.我们看出在宫颈上皮癌变的过程中，随着病变进展，p16蛋白以胞质表达为主，发展为质核共同表达或以胞核表达为主，据此我们推测胞质内p16蛋白可能作为肿瘤抑制基因的静止状态而存在.当需要时，进入细胞核内发挥作用. p16基因及其产物在人类很多原发肿瘤和细胞系中发生改变5 ，但在某些肿瘤及细胞系中，p16基因改变却非常少见，包括宫颈癌及其细胞系中.本实验20%CIN，29%的浸润癌中没有检测到p16蛋白，这可能反映部分宫颈癌及其癌前病变中存在p16基因的丢失，提示p16的失活参与了宫颈癌的发

12、生，并可能发生在宫颈癌的早期阶段，与文献报道一致6 .在对不同年龄组分析发现，p16蛋白表达缺失在低年龄段患者明显高于高年龄组群，这与临床上观察到的现象相符，年轻患者对治疗抵抗，预后不佳.Rb基因缺失或突变，将导致细胞丧失抑制E2F的能力，而进入非正常增殖状态，进而产生肿瘤7 .实验结果显示100%CIN和88%浸润癌中Rb蛋白阳性表达，提示Rb基因突变在宫颈癌发生中出现较晚，仅对于小部分宫颈癌形成起一定作用，在多数宫颈癌发生中，Rb蛋白主要通过HPV感染或cyclin D1过表达引起的功能性失活而参与.宫颈癌中Rb蛋白表达在组织学分级组间有显著性差异（P<0.05），与王英等8

13、，9 报道不一致，这种Rb蛋白在分化差、恶性度高的肿瘤中过表达与其作为抑癌基因的自然属性看起来是自相矛盾的，它产生的原因尚不清楚，有可能是在分化程度差的肿瘤细胞中形成大量较为稳定的Rb蛋白. 参考文献: 1Gong Z，Fu J.Cyclin-dependent kinase4inhibitor a and tumor J.Zhonghua Yixueyichuanxue Zazhi（Chin J Med Genetics），2001;18（3）:219-221. 2Sharpless NE，Depinho RA.The INK4A/ARF locus and its two gene pro

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