核酸分子杂交与应用ppt课件

1、核酸分子杂交：来源一样或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在适宜的条件下经过碱基互补构成双链杂交体的过程称核酸分子杂交(molecular hybridization)。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研讨中运用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。核酸探针的标志探针(probe)是指用放射性核素或其它标志物标志的核酸片段。标志物放射性标志非放射性标志生物素标志地高辛标志荧光素标志探针的种类 DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针又分为： 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基因的

2、全部或部分序列，或某一非编码序列。 cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。探针的种类 DNA探针优点： 1、普通克隆在质粒载体中，可以无限繁衍； 2、DNA探针不易降解 3、DNA的标志方法比较成熟。探针的种类 RNA探针：可以是标志分别的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。其优点是： RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂交反响效率极高 因不存在反复序列，因此特异性高 本底低 缺陷：探针的种类 寡核苷酸(oligo)探针：由1750mer组成的短探针。 优点： 可根据需求人工合成相应的序列； 因片段短，只需一个核苷酸突变，其Tm值也

3、有明显变化，特别适用于点突变的检测 杂交速度快特异性强 缺陷：所带标志物少灵敏度低；片段短杂交体不稳定探针的标志 切口平移法 标志原理：是目前实验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标志法。利用大肠杆菌DNA聚合酶1的多种酶促活性将标志的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标志。 带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。DNase IDNA Pol I,-32P-dNTP标志步骤 1、取1gDNA溶于少量无菌蒸馏水中 2、参与l10 x切口平移缓冲液，混匀 10 x切口平移缓冲液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0.1mol/L MgSO4 1mm

4、ol/L 二硫苏糖醇(DTT) 500g/ml 牛血洁白蛋白标志步骤 3、参与除标志核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标志核苷酸)，20mmol/L溶液各1l。 以下操作要在同位素任务室中有防护措施的情况下进展操作 4、参与100Ci(10l)标志的核苷酸溶液。注：应储存在20oC冰箱中，运用前在室温下放置1530分钟融化。要尽量减少冻融次数。标志步骤 5、参与无菌蒸馏水，至终体积为46.5l，混匀 6、参与0.5l稀释的DNase I溶液，混匀 7、参与1l(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进展 8、置1416oC水浴中保温12小时 9、参与2l 0.5

5、mol/L EDTA终止反响 10、纯化标志的DNA探针单链DNA探针的标志探针的标志 随机引物法 标志原理：随机引物是含有各种能够陈列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反响的引物作用。将待标志的探针模板与随机引物一同退火，合成标志探针。标志步骤 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序参与以下溶液，并混匀 20mmol/L DTT 1l 5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1l 10 x随机引物缓冲液 1l 标志dCTP 3l 水 1l标志步骤 2、取200ng双链DNA溶于1l蒸馏水中，在蜡膜上与1l随机引物充分混匀，吸入一毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴

6、中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入上述离心管中 3、参与1l(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混匀并离心，室温反响3小时以上标志步骤 4、取10l终止缓冲液，置20oC保管备用 终止缓冲液 50mmol/L Tris.Cl(pH7.5) 50mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA 0.5% SDS随机引物标志法特点 1、除能进展双链DNA标志外，也可用于单链DNA或RNA探针的标志。当用RNA为模板是，操作方法同上，但必需采用反转录酶。 2、标志活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使4060以上甚至90的标志dNTP掺入到探针DNA链上 3、操作方便3末端标志

7、末端标志属于部分标志。特点是可得到全长DNA片段，但标志活性不高。3末端标志法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3标志有两种方式：大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标志法T4DNA聚合酶标志法大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标志法：标志反响步骤：(1)在反响管中依次参与以下试剂并混匀 DNA 1g 10 xKlenow片段缓冲液 2l 2mmol/L3种dNTP(无dATP) 1l -32PdATP 30Ci 加水至 25l 10 xKlenow片段缓冲液 2l 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0.1mmol/L MgSO4 1mmol/L DTT(二硫苏

8、糖醇) 500g 牛血洁白蛋白(2)参与1单位Klenow聚合酶片段，室温反响30min。(3)参与12l0.5mol/LEDTA以终止反响。酚/氯仿抽提1次。(4)Sephadex G50柱层析或乙醇沉淀法分别标志的DNA片段。大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标志法：本卷须知：(1)要根据不同限制酶产生的不同粘性末端选择不同的标志核苷酸。(2)选择适当的限制酶及-32P-dNTP,利用DNA聚合酶I Klenow片段的末端填充活性，可以选择性地将DNA双链之中一条链特异地标志。(3)此方法不能直接用于3凸出末端DNA的标志。CCTAGGAATTCAATTCCCTAGG EcoR

9、I BamH I参与DNA聚合酶，dNTP(其中一种为标志核苷酸)AATTCCCTAGGT4DNA聚合酶标志法T4DNA聚合酶具有两种功能，53聚合活性 和35外切活性。当反响体系中缺乏dNTP时，T4DNA聚合酶主要表现为外切酶活性。利用这一特性可产生5凸出的DNA片段，然后参与dNTP，其中之一为标志核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出标志探针。T4DNA聚合酶，无dNTP参与dNTP,其中一种为标志核苷酸标志反响步骤：(1)在反响管中参与以下试剂并混匀 DNA 0.20.5g 1xT4DNA聚合酶缓冲液 2l 加水至 20l(2)参与所需的限制酶，并在适当条件下温育(3)参与适

10、量T4DNA聚合酶。 (4)当切除了所需数量的核苷酸后，参与 1l2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标志核苷酸)，37oC保温一小时。(5)Sephadex G50柱层析或乙醇沉淀法分别标志的DNA片段。5末端标志标志原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使 ATP分子上的磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5OH基团上。因此采用-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5端标志。但核酸样品5端必需是去磷酸的。PP磷酸酶T4多核苷酸激酶ATPPP标志反响步骤：(1)碱性磷酸酶的预处置：碱性磷酸酶(CIP)硫酸铵悬液4oC下在Eppendorf离心管中离心1分钟。弃上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下

11、此溶液可保管一个月以上。(2)将DNA样品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中，然后参与： 10 xCIP缓冲液 5l CIP缓冲液 适量 加水至 48l置37oC30分钟。参与第二份CIP，继续保温30分钟，即可脱去5端磷酸基团。0.01U的CIP，可脱去1pmol5磷酸基团(1.6g4kb线性DNA的5端数相当于1pmol)。 10 xCIP缓冲液 Tris.Cl(pH9.0) 10mmol/L MgCl2 1mmol/L ZnCl2 10mmol/L 亚精胺(3)参与40l H2O，10l 10 xSTE，5l 10SDS。加热至68oC，15分钟。 10 xS

12、TE 100mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mol/L NaCl 10mmol/L EDTA酚/氯仿及氯仿各抽提两次除CIP，SephadexG50层析脱盐后乙醇沉淀。取脱盐后的脱5磷酸DNA150pmol溶于少量水中，然后参与以下试剂进展5末端标志：加水至50ul，混匀，37oC保温1小时。参与2ul0.5mol/LEDTAz终止反响，酚/氯仿抽提后乙沉淀。SephadexG50层析分别后得5标志的DNA探针。-32P-ATP 50pmol(150uCi)T4多核苷酸激酶 1020U10 x激酶缓冲液 10ul本卷须知：(1)T4多核苷酸激酶对多种杂质非常敏感，要求必需到达一定

13、的纯度；脱磷酸后要用SephadexG50层析除去小分子及离子。(2)亚精胺即可促进-32P-ATP的掺入，又能抑制核酸酶的活性 。(3)脱磷酸的DNA样品最好经电泳纯化以除去其中存在的低分子质量的核酸，否那么会竞争性抑制目的DNA的标志 。探针的线纯化凝胶过滤柱层析法利用凝胶的分子筛效应，将标志的DNA与小分子彼此分开。因标志的探针量很小，普通用离心柱层析法。乙醇沉淀法核酸分子杂交的种类和方法核酸分子杂交的根本原理：DNA分子由两条互补的单链构成的双螺旋构造。维持构造稳定的力有三：1、两条链间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆积力(范德华力)；3、中和链内的负电荷。变性：在理化要素作用下，双螺旋

14、构造间的氢键断裂，两条链解开构成单链的过程。变性温度(Tm)：核酸分子热变性时，从开场变性到变性终了，是在一个很窄的温度范围内进展的，当变性进展到核酸分子解链一半时的温度，称变性温度，也称融解温度。影响变性的要素：1、碱基组成 DNA分子中GC含量越高Tm越高。在1SSC溶液中，两者之间的关系可以用阅历公式表示： Tm(G+C)%0.41+69.3其中，69.3为无GC存在时的Tm值。(G+C)%每添加1，Tm约上升0.41oC。影响变性的要素：2、溶液的离子强度 DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们之间的静电相斥作用是其双链的不稳定要素之一。在无盐的水中，DNA在室温下就会变性，参

15、与盐后，正离子可以封锁磷酸基团的负电荷，使DNA稳定性添加，Tm值升高。影响变性的要素：3、pH值 pH值在59范围内，Tm值变化不明显。在高pH值下，可使碱基失去构成氢键的才干。当pH大于11.3时一切氢键均被破坏，DNA完全变性。4、变性剂 可以干扰碱基堆积力和氢键的构成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50的甲酰胺以使Tm值降低30 oC 。复性：变性核酸分子在适宜的条件下重新构成双螺旋构造的过程称复性。热变性的DNA溶液在低于Tm值25 oC的温度下维持相当长的一段时间，那么可使之恢复到天然的双链构造形状。复性的速度受以下要素影响：1、DNA浓度 DNA浓度越大复性

16、速度越快；2、DNA的分子质量 大分子质量的DNA分散速度慢，复性速度慢；3、温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数越少，互补顺序的浓度越低，复性反响速度越慢。分子杂交技术就是利用了核酸分子的变性与复性原理，使变性的核酸分子与检测核酸分子在碱基互补的条件下构成杂交双螺旋的过程。探针(probe)：在核酸变性实验中，为使杂交体与单链核酸分子区分开来所运用的带有标志的单链核酸分子。核酸分子杂交分类：以杂交分子分类：DNA与DNA杂交；DNA与RNA杂交；RNA与RNA杂交。以探针标志分类：以杂交介质分

17、类：液相杂交与固相杂交。固相杂交：菌落杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交及基因芯片等技术。液相杂交(solution hybridization)：是一种比较原始的分子杂交技术。待测分子与探针在杂交液中完成反响，利用层析方法将杂交分子与末杂交分子分开后用液闪仪进展计数或利用紫外吸收特性变化分析杂交结果的分子杂交类型。液相杂交又分为：RNA酶维护分析法、核酸酶S1维护分析法。RNA酶维护分析法(RPA)：利用RNase A和RNase T1能专注性降解单链RNA而双链RNA遭到维护的特点，用体外转录合成的放射性标志的RNA探针与待检mRNA 进展液相杂交，使互补序

18、列RNA探针和待测RNA构成杂交体，用RNase降解非杂交部分RNA后分析杂交结果。RNA酶维护分析法的运用：mRNA定量mRNA未端定位内含子在相应基因中的位置RNA酶维护分析法的主要步骤：1、制备待测RNA 从细胞或组织中提取总RNA或mRNA；2、RNA探针标志 采用体外转录的方法制备和标志探针；3、分子杂交：将待测样品RNA和RNA探针在液相中杂交，杂交前将样品和探针变性，破坏二级构造；4、RNA酶消化单链RNA；5、电泳分析杂交分子。核酸酶S1维护分析法(nuclease S1 protection assay)：原理与RNA酶维护分析法的原理类似，核酸酶S1能专注性地降解单链DNA

19、和RNA，而不能降解DNA/RNA杂交双链。采用M13体系克隆和扩增特定基因的单链DNA片段，在合成过程中参与核素标志物，即可合成出高放射性的单链DNA探针。将探针与待测RNA样品在液相中进展杂交，构成DNA/RNA杂交双链。酶解后进展分析。核酸酶S1维护分析法可用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。液相杂交的优点：设备简单、操作方便。液相杂交的缺陷：过量未杂交探针难以除去，产生高背景；同源与异源核酸均可构成双螺旋构造使得杂交结果难以分析。固相杂交：将欲分析的样品先结合在固相支持物上，再与探针进展杂交反响。杂交结果可用仪器或放射自显影技术分析杂交结果。固相支持物的选择：可用于固相支持物

20、的种类很多。一种良好的固相支持物应具备以下几个特性：1、具有较强的结合核酸分子的才干；2、与核酸分子结合后不影响与探针的结合；3、与核酸分子的结合稳定结实；4、非特异性吸附少；5、具有良好的机械性能便于操作。硝酸纤维素滤膜优点：具有较强的吸附单链DNA或RNA的才干，特别是在高盐浓度下，其结合才干可达80100 g/ cm2。吸附的单链核经真空烘烤后，依托疏水性相互作用而结合在硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜具有杂交信号本底低的特点广泛用于各种杂交实验。缺陷：与单链核酸的结合才干不非常结实，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜时(特别是在高温下)DNA会出现脱膜景象，硝酸纤维素膜质地较脆使操作不

21、便。尼龙膜：是目前较理想的一种核酸固相支持物，它有多种类型，不同类型的膜上网孔大小不同。经正电荷基团修饰后与核酸的结合力更强。尼龙膜与核酸的结合才干为350500 g/ cm2。经烘烤或紫外线照射后，特别是紫外线照射，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上带正电荷的基团相互交联，使结合更加结实。Southern印迹杂交：Southern 印迹杂交过程1、DNA样品的酶切和电泳2、电泳胶的处置3、DNA的转移4、DNA的固定5、DNA膜的杂交杂交过程1、预杂交：为了减少非特异性杂交反响，在杂交前应进展预杂交，将非特异性DNA位点封锁。常用的封锁物有两类：其一是变性的非特异性DNA，大多采用鲑鱼精子DNA或

22、小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封锁DNA上的非特异位点；封锁膜上与非特异性DNA结合位点。预杂交液的配制6SSC1SSC为0.15mol/L NaCl和 o.o15mol/L柠檬酸5Denhardts溶液0.5SDS100g/ml变性的鲑鱼精子DNA50甲酰胺(可不用)50Denhardt：聚蔗糖(Ficoll 400) 5g聚乙烯吡咯烷酮 5g牛血洁白蛋白(组分V) 5g加水至500ml，分装后保管于20oC10mg/ml鲑鱼精DNA：超声法或用注射器经过6号针头反复抽打将DNA打断。煮沸后置20oC保管，运用前置沸水浴中煮沸5分钟后速置冰浴中。甲酰胺：运用前用Dowe

23、x XG8混合床阴阳离子交换树脂处置1小时，小量分装后置70oC保管。膜的处置：将结合了DNA(或RNA)的硝酸纤维素膜或尼龙膜浸泡于6SSC溶液中2分钟，使其充分潮湿。预杂交：将潮湿的滤膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量参与预杂交液，尽量排除其中的气泡后用封口机封口。温育：将杂交袋浸入适当温度的恒温水浴中(不加甲酰胺时用68oC；参与50甲酰胺时，恒温42oC)，温育12小时，也可延伸至1216小时。保温过程中应不断摇动塑料袋，以赶走盖在滤膜外表的气泡，否那么这些气泡将妨碍杂交液与滤膜的接触。(假设将预杂交液加热到适当温度后再参与塑料袋内，可以减少气泡产生)。2、杂交：杂交反响是单

24、链核酸探针与待测核酸分子中的特异基因序列在一定的温度下杂交复性的过程。杂交包括以下过程：1、杂交液配制：同预杂交液2、探针变性：放射性标志的探针为双链时，于100oC加热5分钟变性并迅速在冰水浴中将探针骤冷。单链探针无须变性3、翻开预杂交袋弃去预杂交液，参与杂交液及变性的探针。排除气泡后重新封好口4、在与预杂交一样温度下，保温816小时洗膜：是将滤膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从滤膜上洗去的过程，非特异性杂交体稳定性较低，解链温度较低，在一定温度下，非特异性杂交体解链而被洗掉，而特异性杂交体那么保管在滤膜上。杂交体的解链温度主要取决于杂交体的同源性和溶液的离子强度两个要素，同源性越高离子强度越高，杂交体的稳定性越高。洗膜的操作如下：1、杂交终了，取出杂交袋，剪去一角，弃去一切的杂交液，取出膜并迅速浸泡于大量2SSC和0.5% SDS溶液中，室温下不断振荡。留意不要使滤膜枯燥。2、5分钟后，将滤膜转移至一盛有大量2SSC和0.1% SDS溶液的容器中，室温振荡15分钟