第四章 固相析出分离法2013

1、n通过改变溶液条件，使溶质以固体形式通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。从溶液中分出的操作技术。n盐析法盐析法n有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n等电点沉淀法等电点沉淀法n结晶法结晶法2salt precipitation定义：定义：是利用各种生物分子是利用各种生物分子在在浓盐溶液中溶解度的差异浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使的中性盐，使目的物目的物或或杂蛋杂蛋白白以沉淀以沉淀析出析出，达到纯化目，达到纯化目的的方法。的的方法。优点：优点：简单、经济、较少变性简单、经济、较少变性缺点：缺点：分辨率不高，要除盐分辨率不高，要除

2、盐3两种现象：两种现象：盐溶：盐溶：低盐情况，盐离子强低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度度的增高，蛋白质溶解度增大。增大。盐析：盐析：高盐，盐离子强度增高盐，盐离子强度增加，蛋白质加，蛋白质溶解度减小。溶解度减小。42.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0溶解度溶解度盐浓度盐浓度Salting-outSalting-in6n形成形成离子对离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。n中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白

3、质脱去了水化膜水化膜，使其沉淀。，使其沉淀。7loglogS S= = - -K Ks s S S蛋白质溶解度蛋白质溶解度，g/Lg/L； 盐离子强度盐离子强度, , C Ci ii i离子浓度，离子浓度，mol/Lmol/L；Z Zi ii i离子化合价；离子化合价； 常数常数, ,为纵坐标上的截距为纵坐标上的截距; ;K Ks s盐析常数盐析常数。82.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0 、 K KS Sn 是外推截距是外推截距nK KS S是盐析常数是盐析常数KsKs盐析法盐析法盐析法盐析法9方法方法: : （一）盐的性质（一）盐的性质

4、 盐析能力：盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子高价阴离子更为明显。更为明显。 PO4 3-SO42CH3COOClNO3I NH4+K+Na+Li+ 盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵11几种盐在不同温度下的溶解度（克几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）毫升水）n盐种类盐种类 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1

5、.6 7.8 93.8 10113-d dSP10987654321040 50 60 70 80P30g/L 3g/Ln温度的变化会影响温度的变化会影响 值。值。n在无盐或稀盐溶液中，在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，随温度升高而增大的，但在但在高盐溶液中常相反高盐溶液中常相反14210log S2 3 4 250pH6.615卵清蛋白碳氧血红蛋白765432103 4 5 6 7 8pH161718192021向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。2223一、基本原理2425 常用的溶剂有乙醇、丙酮

6、、甲醇等。常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。 许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液溶液pHpH应在应在等电点附近等电点附近，还须考虑蛋白质的稳，还须考虑蛋白质的稳定性。定性。26 有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。随温度降低而显著地减小。 低盐：低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。性。 高盐：高盐：增大蛋白质在有机溶剂增大蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。解度，沉淀物中可能夹带盐。272829303132二、成盐沉淀法二、

7、成盐沉淀法333435吸附人造沸石盐析45%饱和硫酸铵沉淀TCA透析363738酸性多糖3940n溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列。的结点上呈规则的排列。n固体有结晶和无定形两种状态。固体有结晶和无定形两种状态。n结晶：结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则列，粒子排列有规则n无定形固体：无定形固体：

8、析出速度快，粒子排列无规则析出速度快，粒子排列无规则- -沉淀。沉淀。41n只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。过程有良好的选择性。n通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。n结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。酸等产品的精制。 AFMAFM（原子力显微镜

9、）下的抗生素晶体（原子力显微镜）下的抗生素晶体 AFMAFM下的抗生素晶体层下的抗生素晶体层一、结晶过程一、结晶过程n饱和溶液：饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液。条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液。n过饱和溶液：过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液。液称之为过饱和溶液。n溶质只有在过饱和溶液中才能析出。溶质只有在过饱和溶液中才能析出。n溶质溶解度与温度、溶质分散度（晶体大小）有溶质溶解度与温度、溶质分散度（晶体大小）有关。关。凯尔文（Kelvin）公式：

10、指溶质自动从指溶质自动从过饱和溶液过饱和溶液中析出形成新相的过程中析出形成新相的过程。 C C2 2 小晶体的溶解度小晶体的溶解度；C C1 1 普通晶体的溶解度；普通晶体的溶解度； 晶体密度；晶体密度；M M 晶体质量；晶体质量； 晶体与溶液间的界面张力；晶体与溶液间的界面张力； 2 2 小晶体的半径小晶体的半径； 1 1 普通晶体的半径；普通晶体的半径；46)11(2ln1212rrRTMCC结晶过程的实质结晶过程的实质n结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。相的过程。n这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这一过程不仅包括溶质分

11、子凝聚成固体，还包括这些分子有规律地排列在一定晶格中，这一过程这些分子有规律地排列在一定晶格中，这一过程与表面分子化学键力变化有关。与表面分子化学键力变化有关。n因此，结晶过程是一个因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。表面化学反应过程。晶体的形成晶体的形成n形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。体析出。n首先形成晶核，由首先形成晶核，由KelvinKelvin公式，微小

12、的晶核具有公式，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种处于一种形成形成溶解溶解再形成再形成的动态平衡之中，的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在存在。n过饱和度过饱和度S：*ccS 最先析出的微小颗粒是以后晶体的中心，称为晶核。最先析出的微小颗粒是以后晶体的中心，称为晶核。晶体的形成过程：晶体的形成过程： 过饱和溶液的形成过饱和溶液的形成 晶核的形成晶核的形成 晶体生长晶体生长其中，其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度

13、是结晶的推动力。饱和度是结晶的推动力。温度与溶解度的关系温度与溶解度的关系n由于物质在溶解时要吸收热量、结晶时要由于物质在溶解时要吸收热量、结晶时要放出结晶热。因此，结晶也是一个质量与放出结晶热。因此，结晶也是一个质量与能量的传递过程，它与体系温度的关系十能量的传递过程，它与体系温度的关系十分密切。分密切。n溶解度与温度的关系可以用饱和曲线和过溶解度与温度的关系可以用饱和曲线和过饱和曲线表示。饱和曲线表示。（饱和区）53 饱和曲线和过饱和曲线饱和曲线和过饱和曲线稳定区介稳区不稳定区区域名称不饱和区（溶解区）亚稳区 过饱和区区域范围曲线0下方曲线0和2之间曲线2上方溶液特点不饱和溶液 略过饱和溶

14、液过饱和溶液液相与溶质晶体关系无晶体析出现象，外加晶体溶解晶核不会自动形成，但诱导可以产生，若有晶体存在可以长大可以自然产生大量晶核，晶体也可长大表表 各区域内溶液特性及其与溶质晶体关系各区域内溶液特性及其与溶质晶体关系55l蒸发法蒸发法58 60三、晶核的形成三、晶核的形成(1) (1) 初级成核初级成核: :过饱和溶液中的自发成核现象。过饱和溶液中的自发成核现象。a a 均相成核：没有外来表面的均相溶液中。均相成核：没有外来表面的均相溶液中。b b 非均相成核：外来表面的溶液中。非均相成核：外来表面的溶液中。(2) (2) 二次成核：向介稳态过饱和溶液中加入晶种，二次成核：向介稳态过饱和溶

15、液中加入晶种，会有新晶核产生。会有新晶核产生。机理机理: : 附着在晶体表面的微小晶体受到剪切作用，附着在晶体表面的微小晶体受到剪切作用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。四、晶体的生长四、晶体的生长n在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，称为晶体的生长。称为晶体的生长。n是以浓度差推动力的扩散传质和晶体表面反是以浓度差推动力的扩散传质和晶体表面反应（晶格排列）的两步串连过程。应（晶格排列）的两步串连过程。63（二）晶体形状（二）晶体形状 改变晶体外形，可用改变晶体外形，可用: :选择不同的溶剂、选择不同的溶剂、控制控制过饱和度、过饱和度、结晶温度结晶温度、调节溶液的、调节溶液的pHpH和有目的地和有目的地加入某种能改变晶形的杂质等。加入某种