实验微生物的分离纯化剖析

1、微生物的分离纯化目的要求v 掌握倒平板的方法；掌握倒平板的方法；v 掌握几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。掌握几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。微生物分离培养技术v平板划线平板划线分离法分离法 v混合倒平板混合倒平板分离法分离法 v单孢子或单细胞单孢子或单细胞分离法分离法 v选择性培养基选择性培养基分离法分离法 v平板涂布平板涂布分离法分离法 平板划线分离法v 用接种环无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行划线，如用接种环无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌果划线适宜的话，微生物能一一分散

2、，经培养后，可在平板表面得到单菌落。落。平板涂布分离法v 吸取吸取0.1ml0.1ml菌液接种在琼脂平板上，用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，如果样品稀释适当的话，微生菌液接种在琼脂平板上，用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，如果样品稀释适当的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。混合倒平板分离法v 将适当稀释的菌悬液将适当稀释的菌悬液lmllml放入空平板中，倒入已融化并冷却至放入空平板中，倒入已融化并冷却至45455050的细菌培养基，轻轻转动平板，使的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。如

3、果样品稀释适当的话，微生物能一一分散，经培养后，菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。如果样品稀释适当的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。可在平板表面得到单菌落。单孢子或单细胞分离法v采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养行培养以获得纯培养 。v在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来

4、，然后移到合适的培养基进行培养。上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。 选择性培养基分离法v各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。微生物纯培养分离方法的比较分离方法分离方法应用范围应用范围平皿划线法平皿划线法方法简便，多用于分离细菌方法简便，多用于分离细菌混合倒平皿法混合倒平皿法既可定性，又可定量，用途广

5、泛既可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究局限于高度专业化的科学研究选择培养基法选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊适用于分离某些生理类型较特殊的微生物的微生物平皿涂布法平皿涂布法既可定性，又可定量，用途广泛既可定性，又可定量，用途广泛实验器材 v 样品：桂子山土壤样品。样品：桂子山土壤样品。v 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基v 器材：器材：90ml无菌水、无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。一、平板划线法操作步骤1

6、、倒平板倒平板2、样品稀释样品稀释3、平板划线平板划线倒平板v在微波炉中加热将灭好菌的固体培养基融化，待冷却至在微波炉中加热将灭好菌的固体培养基融化，待冷却至55556060C C时，右手持装有培养基的三角瓶置酒精灯火焰旁，用左手时，右手持装有培养基的三角瓶置酒精灯火焰旁，用左手将瓶塞轻轻拔出，瓶口对着火焰；用右手小指和手掌边缘或小将瓶塞轻轻拔出，瓶口对着火焰；用右手小指和手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞，左手拿培养皿并将皿盖在酒精灯火焰附指与无名指夹住瓶塞，左手拿培养皿并将皿盖在酒精灯火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，加盖后轻

7、轻摇动培养皿，使培养基均匀分布。使培养基均匀分布。样品稀释 v准确称取待测样品准确称取待测样品l0gl0g，放入装有，放入装有90ml90ml无菌水无菌水并放有小玻璃珠的并放有小玻璃珠的250ml250ml三角瓶中，用手或置三角瓶中，用手或置摇床上振荡摇床上振荡20 min20 min，使微生物细胞分散，静，使微生物细胞分散，静置置20-30s20-30s，即成，即成1010-1-1稀释液；再用稀释液；再用1ml1ml无菌吸无菌吸管，吸取管，吸取1010-1-1稀释液稀释液lmllml，移入装有，移入装有9ml9ml无菌水无菌水的试管中，吹吸的试管中，吹吸3 3次，让菌液混合均匀，即成次，让菌

8、液混合均匀，即成1010-2-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取稀释液；再换一支无菌吸管吸取1010-2-2稀释稀释液液1 ml1 ml，移入装有，移入装有9ml9ml无菌水的试管中，也吹无菌水的试管中，也吹吸三次，即成吸三次，即成l0l0-3-3稀释液；以此类推，连续稀稀释液；以此类推，连续稀释，制成释，制成1010-1-1、1010-2-2、1010-3-3、1010-4-4、1010-5-5、1010-6-6等一系列稀释的土壤悬液。等一系列稀释的土壤悬液。样品稀释平板划线v 在酒精灯火焰附近，左手拿培养皿，右手拿接种环，挑取上述在酒精灯火焰附近，左手拿培养皿，右手拿接种环，挑取上述1010-

9、1-1的土壤悬液一环，在平板上划线。的土壤悬液一环，在平板上划线。v 划线方法有：划线方法有：平行划线平行划线和和连续划线连续划线。平行划线法连续划线法划线平板菌落生长状况二、平板涂布法操作步骤1、倒平板、倒平板2、样品稀释、样品稀释3、平板涂布平板涂布平板涂布v 用无菌吸管吸取用无菌吸管吸取0.1ml0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮

10、铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上202030min30min，使菌液渗透入培养基内，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养。然后将平板倒转，保温培养。 三、混合倒平板法操作步骤1、样品稀释、样品稀释2、混合倒平板混合倒平板混合倒平板 v将无菌平板编上将无菌平板编上1010-4-4、1010-5-5、1010-6-6号码，每一号码设置三个重复，号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取用无菌吸管按无菌操作要求吸取1010-6-6稀释液各稀释液各1ml1ml放入编号放入编号1010-6-6的的3 3个平板中，同法吸取个平板中，同法吸取1010-5-5稀释液各稀释液各lmllml放入编号放入编号1010-5-5的的3 3个平个平板中，再吸取板中，再吸取1010-4-4稀释液各稀释液各lmllml放入编号放入编号1010-4-4的的3 3个平板中