分子生物学 第三章 DNA的复制和修复

1、精选ppt 第三章第三章 DNA的复制的复制 DNADNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。链大分子，是遗传信息的携带者。 生物体的遗传信息就贮存在生物体的遗传信息就贮存在DNADNA的四种的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。脱氧核糖核酸的排列顺序中。 精选ppt DNA DNA通过复制将遗传信息由亲代传递通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；给子代； 通过转录和翻译，将遗传信息传递给通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。蛋白质分子，从而决定生物的表现型。 DNA DNA的复制、转录和翻译过程就构成的复制、转录和翻译

2、过程就构成了了遗传学的中心法则遗传学的中心法则。 精选ppt 在在RNARNA病毒中，其遗传信息贮存在病毒中，其遗传信息贮存在RNARNA分子中。分子中。 因此，在这些生物体中，遗传信息的因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是流向是RNARNA通过复制，将遗传信息由亲代通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给递给DNADNA，再由，再由DNADNA通过转录和翻译传递通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就丰富给蛋白质，这种遗传信息的流向就丰富了了中心法则的内容中心法则的内容。精选pptDNA dependent DNA poly

3、meraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDP 复制（复制（DDDPDDDP） 转录（转录（DDRPDDRP） 翻译翻译 DNA RNA DNA RNA 蛋白质蛋白质 反转录（反转录（RDDPRDDP） RNA RNA 复制（复制（RDRPRDRP） 精选ppt精选ppt 第一节第一节 DNADNA复制概况复制概况 一一. DNA. DNA复制的半保留性复制的半保留性 DNA DNA在复制时，以亲代在复制时，以亲代DNADNA的每

4、一股的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代作模板，合成完全相同的两个双链子代DNADNA，每个子代，每个子代DNADNA中都含有一股亲代中都含有一股亲代DNADNA链，这种现象称为链，这种现象称为DNADNA的半保留复制的半保留复制(semi-conservative replication)(semi-conservative replication)。 精选ppt DNA DNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在19581958年由年由M. M. Meselson Meselson 和和 F. Stahl F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验所完成的实验所证明

5、。该实验首先将大肠杆菌在含首先将大肠杆菌在含1515N N的培养基中培养约十五代，使的培养基中培养约十五代，使其其DNADNA中的碱基氮均转变为中的碱基氮均转变为1515N N。将大肠杆菌移至只含。将大肠杆菌移至只含1414N N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNADNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：，作密度梯度离心，可得到下列结果： 精选ppt二二. . 复制子（replicon) 复制子:基因组中能单独进行复制的单位。 每个起始点到终止点的区域为一个复制子。 精选ppt1. 起始点（origin of replication ,

6、ori) 原核生物DNA分子中只有一个起始点，长度 200bp左右。 大肠杆菌ori C有245 bp。 真核生物有多个复制起始点。精选ppt精选ppt E.coli 中的Ori区富含AT和回文对称的序列。 这种特殊的结构与复制起点易于解链以发动DNA复制（形成“呼吸现象”）和促进聚合酶与DNA结合的功能高度统一。精选ppt isolation of ori精选ppt rich AT & palindromerich AT & palindrome Enzymes binding site Enzymes binding site 300 bp 300 bp in replic

7、ation origin in replication origin 0f Prokaryote 0f ProkaryoteAT rich复制起点的特征复制起点的特征精选ppt大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型精选ppt2. 终点（ter） 对E.coli DNA复制过程

8、的研究发现，其两个复制叉总是在一个固定的位点相遇，这个特殊的位点包含两个分别由3个终止子（terminus）组成的终止区域ter E，ter D，ter A和ter F，ter C，ter B，其中每个终止子含有相对保守的22bp序列（有说23bp共有序列？） ，分别负责对不同区域的复制叉行使终止功能。精选ppt 目前已经分离出相对分子质量为3.6103的终止蛋白Tus（terminus utilization substance）。 这种终止蛋白能识别ter序列，形成terTus复合体，以防止DNA过度复制，避免出现DNA多聚体。 精选ppt 为了保证DNA复制的完整性，每一个复制叉必须穿过

9、另一复制叉的终止区才能到达自身终止区，并可以在其中3个位点的任一个位点发生终止。 如果两个复制叉的延伸速度不一致，或因某种原因一个复制叉的延伸过程被拖延，先期到达终止子的复制叉会停留等待另一复制叉的经过，共同完成全基因组的复制过程。 精选ppt三. 复制的方向性 复制的方向：单向或双向 精选ppt 复制的多模式复制的多模式 单起点、单方向单起点、单方向多起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向单起点、双方向多起点、双方向多起点、双方向精选ppt Direction of DNA replication单向复制双向复制精选ppt双向复制双向复制 DNADNA复制时，以复制起始点为中心，向复制时，

10、以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。也可进行单向复制（如滚环复制）。 精选ppt精选ppt精选ppt精选ppt四四. . 引物引物RNARNA DNA复制的起始必须先期合成一段引复制的起始必须先期合成一段引物分子。物分子。 研究表明无论是原核生物还是真核生研究表明无论是原核生物还是真核生物，大多数引物复制是一段长度不等的，物，大多数引物复制是一段长度不等的，一般为一般为10个核苷酸左右的个核苷酸左右的RNA分子分子。（有。（有说说为为1 11010个核苷酸？）个核苷酸？） 精选ppt 所有DNA聚合酶具有一个

11、共同的特点均不能自主地发动DNA的复制，只能利用已提供的核苷酸3OH末端聚合dNMP，合成DNA链。 它们必须以一段具有它们必须以一段具有33端自由羟基（端自由羟基（3-3-OHOH）的）的RNARNA作为引物作为引物(primer) (primer) ，才能开始聚合，才能开始聚合子代子代DNADNA链。链。 引物引物RNARNA的碱基顺序，与其模板的碱基顺序，与其模板DNADNA的碱基的碱基顺序相配对。顺序相配对。精选ppt五五. DNA. DNA的半不连续复制的半不连续复制 由于由于DNADNA聚合酶只能以聚合酶只能以5353方向聚合方向聚合子代子代DNADNA链链，即，即模板模板DNAD

12、NA链链的的方向必须为方向必须为3535。 因此，分别以两条亲代因此，分别以两条亲代DNADNA链作链作为模板聚合子代为模板聚合子代DNADNA链时的方式是不链时的方式是不同的。同的。精选ppt 以以3535方向的亲方向的亲代代DNADNA链作模板的子代链链作模板的子代链在复制时基本上是连续进在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方行的，其子代链的聚合方向为向为5353，这一条链，这一条链被称为被称为前导链前导链(leading (leading strand)strand)。 而以而以5353方向的方向的亲代亲代DNADNA链为模板的子代链为模板的子代链在复制时则是不连续的，链在复制时则

13、是不连续的，其 链 的 聚 合 方 向 也 是其 链 的 聚 合 方 向 也 是5353，这条链被称为，这条链被称为滞后链滞后链(lagging strand)(lagging strand)。精选ppt 由于亲代由于亲代DNADNA双链在复制时是逐步解双链在复制时是逐步解开的，因此，滞后链的合成也是一段一开的，因此，滞后链的合成也是一段一段的。段的。DNADNA在复制时，由滞后链所形成的在复制时，由滞后链所形成的一些子代一些子代DNADNA短链称为短链称为冈崎片段冈崎片段(Okazaki (Okazaki fragment)fragment)。 冈崎片段的大小，在原核生物中约冈崎片段的大小，

14、在原核生物中约为为1000100020002000个核苷酸，而在真核生物个核苷酸，而在真核生物中约为中约为100100个核苷酸。个核苷酸。 精选ppt 第二节参与第二节参与DNADNA复制的酶、相复制的酶、相关蛋白及酶学机制关蛋白及酶学机制 在细胞中，双螺旋在细胞中，双螺旋DNADNA复制是复制是DNADNA聚聚合酶催化的酶促反应过程。合酶催化的酶促反应过程。但但DNADNA聚合酶只能延长已有的聚合酶只能延长已有的DNADNA或或RNARNA引物链，不能从头起始引物链，不能从头起始DNADNA链的合链的合成成精选ppt另外，在另外，在DNADNA复制中形成特殊的复制复制中形成特殊的复制叉（或生

15、长叉）结构区内，叉（或生长叉）结构区内，DNADNA双螺旋中双螺旋中的两条链缠绕在一起，要拷贝每一条链的两条链缠绕在一起，要拷贝每一条链都必须将双螺旋都必须将双螺旋DNADNA解旋（解旋（unwindingunwinding），），并释放或吸收由此产生的扭力，这就要并释放或吸收由此产生的扭力，这就要求双螺旋和超螺旋的解旋与重新形成求双螺旋和超螺旋的解旋与重新形成DNADNA聚合酶不能完成这一过程聚合酶不能完成这一过程精选ppt在不连续合成中形成短的冈崎在不连续合成中形成短的冈崎片段（片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment）的连接）的连接也是也是DNADNA聚合酶

16、无法完成的。聚合酶无法完成的。实际上，在复制叉处进行复杂实际上，在复制叉处进行复杂的的DNADNA复制过程中，需要许多相关的复制过程中，需要许多相关的酶和蛋白因子参与。酶和蛋白因子参与。精选ppt除除DNADNA聚合酶外，还包括：聚合酶外，还包括： DNADNA旋转酶旋转酶； 使使DNADNA双股链在复制叉解开的双股链在复制叉解开的解旋酶解旋酶； 在在DNADNA复制前防止解开的复制前防止解开的DNADNA单链局部退火的单链局部退火的DNADNA结合蛋白结合蛋白； 合成合成RNARNA引物的酶引物的酶； 除去除去RNARNA引物的酶；引物的酶； 使冈崎片段共价连接的使冈崎片段共价连接的DNAD

17、NA连接酶连接酶等重要的酶等重要的酶与蛋白因子。与蛋白因子。精选ppt DNA聚合酶、引物的引发酶、DNA解旋酶、单链结合蛋白、连接酶等在内的如此众多的酶分子均集中在复制交叉处组成一个复合体协同互作，共同完成DNA分子的复制过程，这种复合体也称为DNA复制体（replisome） 。精选ppt一. DNA聚合酶（一）（一）原核生物原核生物DNADNA聚合酶聚合酶种类种类 在原核生物中，目前发现的在原核生物中，目前发现的DNADNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase,DNA pol)有五种有五种: : DNADNA聚合酶聚合酶（ DNADNA pol pol ）、）、 DNA DNA聚合

18、酶聚合酶（ DNADNA polpol）、）、 DNA DNA聚合酶聚合酶（ DNADNA polpol）、）、 DNA DNA聚合酶聚合酶（ DNADNA pol pol ）、）、 DNA DNA聚合酶聚合酶（ DNADNA polpol） 精选ppt 前三种酶（前三种酶（DNADNA聚合酶聚合酶、DNADNA聚合酶聚合酶、 DNADNA聚合酶聚合酶都属于具有多种酶活性的多功能都属于具有多种酶活性的多功能酶。酶。 DNADNA聚合酶聚合酶催化催化DNA新链中脱氧核苷酸之新链中脱氧核苷酸之间的聚合反应的酶。间的聚合反应的酶。 参与参与DNADNA复制的主要是复制的主要是polpol和和polp

19、ol。 精选ppt. DNA聚合酶I 1958年Kornberg首先从大肠杆菌提取DNA聚合酶I 。 大肠杆菌K-12株的DNA聚合酶I由基因polA编码，由928个氨基酸组成，分子量103.1kDa，结构类似球状，直径约650nm，每个细胞约有400个分子。 精选ppt 此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。精选ppt 1）聚合作用：5 3； 2）3 5外切酶活性：校对（或正）功能； 3）5 3外切酶活性：引物切除、损伤修复，主要功能是切除引物、填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复；精选ppt精选ppt精选ppt 如果新链合成过程中出

20、现错配，新添加的核苷酸因为与模板不能正确配对，将形成单链尾巴，此单链末端可被DNA聚合酶识别，并以3-5外切酶活性切除此核苷酸，再用其聚合酶活性配对正确的核苷酸，此功能被称为校读功能。精选ppt DNA pol是单一肽链的大分子,分子量为109kD,二级结构以-螺旋为主。 用特异的蛋白酶（如枯草杆菌蛋白酶）处理，可把DNA pol水解为两个片段，即在F，G螺旋之间发生断裂。 精选ppt 小片段，具有323个氨基酸残基，小片段的分子量为35KD，具有 5 3外切酶活性。 可以逐个切除处于配对状态的具5磷酸末端的核苷酸，一次最多可以切除10个核苷酸。 精选ppt 大片段或称Klenow片段，具有6

21、04个氨基酸残基，分子量为68KD， 具有DNA聚合酶活性和3 5外切酶活性； 53聚合酶活性使Klenow片段可以3OH末端添加新的核苷酸延长已存在的多核苷酸链。 精选ppt 3-5外切酶活性则令Klenow片段可以从DNA的3端，即新链生长端开始逐个切除核苷酸。 此活性倾向于切除DNA合成中的末端错配碱基。精选ppt 以上三重活性相结合，使DNA聚合酶I适用于取出起始DNA合成所需的RNA引物，并填充去除引物后DNA双链中出现的短单链区域。 精选ppt 类似的短单链区域也可出现在DNA损伤修复过程中切除错误碱基后，故DNA聚合酶I也可用于损伤DNA的修复。 但DNA聚合酶I的延伸能力不强，

22、与模板接合一次只能使核苷酸链延长20-100个核苷酸，在新链的延长反应中不可能起主要作用。精选ppt pol pol为单一肽链的大分子蛋白质为单一肽链的大分子蛋白质, ,可被特可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为为Klenow fragmentKlenow fragment，具有，具有5353聚合酶聚合酶活性活性和和3535外切酶外切酶的活性。的活性。 精选ppt精选ppt精选ppt2. DNA聚合酶I I DNA聚合酶I I具有 5 3聚合酶活性及3 5外切核酸酶活性。精选ppt3. DNA聚合酶I I I 该酶由10 个亚基组成，分别为、

23、及。 DNA聚合酶具很强的延伸能力，能在新链上每分钟添加105个核苷酸。 它是原核生物体内真正起复制作用的酶。精选ppt亚基： 5 3聚合酶活性；亚基：3 5外切酶,校对和编辑；为装配必须； 以上三者构成核心酶。精选pptDNA聚合酶为不对称异源二聚体 每个DNA聚合酶含有二个拷贝的核心酶，另外有二个拷贝的二聚化亚基 连接这二个核心酶； 二个拷贝的 亚基负责保持核心酶与模板链的结合并使酶能够沿模板链移动； 另外五种亚基组成复合体，可促进全酶组装并使 亚基结合到DNA上。精选ppt大肠杆菌DNA聚合酶精选ppt pol pol 由十种亚基组成，其中由十种亚基组成，其中亚亚基具有基具有5353聚合

24、聚合DNADNA的酶活性，因而的酶活性，因而具有复制具有复制DNADNA的功能；而的功能；而亚基具有亚基具有3535外切酶的活性，因而与外切酶的活性，因而与DNADNA复制复制的校正功能有关。的校正功能有关。 精选ppt大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全酶的结构和功能全酶的结构和功能 延长因子延长因子DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶校对校对引物的结引物的结合和识别合和识别促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化精选ppt前导链与后随链复制的方向不同 位于前导链DNA延伸点的复制体在完成一个冈崎片段的复制后必须解体，或

25、以复制体整体方式才冈崎片段的末端解离后又迅速“调转车头”结合到新的起点合成冈崎片段。 在大肠杆菌中完成一次基因组复制，复制体需要启动20004000次的冈崎片段的复制。精选ppt 显然这种模式是不符合生物进化的“经济原则”的。 随后的研究证明每一个复制叉均含有一个DNA聚合酶的二聚体，它可以同时催化前导链和后随链的同时复制。基于这一科学发现，人们提出了在双链DNA复制进程中“回环模型”。精选ppt回环模型 即在复制叉处仅有一个大型的DNA复制体，后随链的一个冈崎片段模板DNA以倒退的方式从DNA聚合酶中将模板DNA释放出来，新冈崎片段的DNA单链与前导链一样，以相同的方向完成复制。 以滚环模式

26、扩增DNA的生物在复制叉处也是按回环模型完成DNA复制的。精选ppt精选ppt聚合酶聚合酶III核心酶核心酶大肠杆菌复制大肠杆菌复制体结构示意图体结构示意图聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶III核心酶核心酶滞后链滞后链前导链前导链解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成酶RNA引物引物引发体引发体拓扑异构酶拓扑异构酶II -夹子夹子 -聚体聚体 -夹子夹子 -复合物复合物RNA引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB）精选ppt复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物引物体引物体引物体引物体解旋酶解

27、旋酶解旋酶解旋酶精选ppt精选ppt性质 聚合酶聚合酶聚合酶3 5 外切活性+ + + +5 3 外切活性+-5 3 聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生链合成-+主要是对主要是对DNADNA损伤的修损伤的修复；以及在复；以及在DNADNA复制时复制时切除切除RNARNA引物并填补其引物并填补其留下的空隙。留下的空隙。修复紫外修复紫外光引起的光引起的DNADNA损伤损伤DNA DNA 复制的主要复制的主要聚合酶，还具有聚合酶，还具有3 3-5-5 外切酶的外切酶的校对功能，提高校对功能，提高DNADNA复制的保真性复制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）精选pptDNADNA聚合酶的聚合

28、酶的3 - 5 外切酶水解位点外切酶水解位点3 3 5 5 错配碱基错配碱基3 - 5 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点精选pptDNA聚合酶聚合酶5 - 3 外切酶活力外切酶活力5 - 3 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点单链缺口单链缺口5 精选ppt DNA聚合酶和是在1999年才被发现的，它涉及DNA的错误倾向修复(errorprone repair)。 当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性（accuracy)，因而出现高突变率。 高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。精选ppt（二）真核生物中的（二）真核生物中的

29、DNADNA聚合酶聚合酶 在真核生物中，目前发现的在真核生物中，目前发现的DNADNA聚合聚合酶有五种，分别命名为酶有五种，分别命名为DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol）。）。精选ppt 其中，参与染色体其中，参与染色体DNADNA复制的是复制的是polpol（延长滞后链）和（延长滞后链）和polpol（延长前（延长前导链），导链）， 参与线粒体参与线粒体DNADNA复制的是复制的是polpol， p

30、olpol与与DNADNA损伤修复、校读和填补损伤修复、校读和填补缺口有关，缺口有关， polpol只在其他聚合酶无活性时才发只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。挥作用。 精选ppt其他学者的意见：真核生物DNA聚合酶、及四种，都有5 3聚合功能。及参与核DNA复制； ：链合成的引发，：链的延长 pol；切除引物后填补空隙 ：外切核酸酶 ：线粒体DNA复制精选ppt 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核3-5外切 - - + + +酶活性功能引物引物 合成合成修复修复作用作用线粒体线粒体DNADNA的复制的复制核核DNADNA的复制的复制？真核生物中的DNA聚合酶精选ppt 至今为止，所

31、有已发现的DNA聚合酶都不能从头合成多核苷酸链，而只能通过从3OH末端添加新的核苷酸延长已存在的多核苷酸链。 此特性决定了复制中新链的合成方向。 精选ppt（三）（三）DNADNA复制的保真性（即忠实性）复制的保真性（即忠实性） 为了保证遗传的稳定，为了保证遗传的稳定，DNADNA的复制必的复制必须具有高保真性。须具有高保真性。DNADNA复制时的保真性主复制时的保真性主要与下列因素有关：要与下列因素有关： 1 1遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律； 2 2DNADNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；聚合酶在复制时对碱基的正确选择； 3 3对复制过程中出现的错误及时进行校对复制过程

32、中出现的错误及时进行校正。正。合成时以RNA为引物精选pptDNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能5 5 - -核酸核酸外切酶外切酶3 3 - -核酸核酸外切酶外切酶裂缝裂缝聚合中心聚合中心裂缝内部裂缝内部精选pptDNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配硷基错配硷基复制方向复制方向正正 确核确核苷酸苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸精选pptDNA复制为什么要合成一个复制为什么要合成一个RNA引物，而引物，而后又把这个引物消除呢？后又把这个引物消除呢？ 这是保证这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。聚合过程高度精确的又一措施。

33、已知已知DNA 聚合酶具有聚合酶具有35 外切酶功能校对复制外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。就决定了它不能从头开始合成。 因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时暂时”的，当的，当DNA开始聚合以后再以开始聚合以后再以53 外切酶的功能切除，以高外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之

34、，确保复制的忠实性。忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。精选ppt二二. .DNADNA旋转酶与旋转酶与DNADNA超螺旋的超螺旋的松驰松驰天然DNA的负超螺旋虽然有利于DNA的解旋，但随着复制的进行，复制叉前方亲代DNA中仍积累巨大的张力，因此复制中需要DNA旋转酶去除解螺旋酶的解链产生的扭曲张力。精选ppt大肠杆菌中的DNA旋转酶（gyrase）又称拓扑异构酶（topoisomerase ），由四个亚基组成四聚体22真核的呈二聚体。DNA旋转酶的作用机制如图5-6所示。精选ppt图5-6 DNA旋转酶引入超螺旋的分子模型：DNA双链以右手方向绕在四聚体的酶上； ：DNA双链被切断

35、，两个亚基以其连接处为铰链转动，张开其靠近DNA断裂点的部分； ：未断的DNA双链 穿过切口； ：连接断裂的DNA，以左手方向绕在酶分子上； ：连接好的DNA释放出来。精选ppt ：DNA双链以右手方向绕在四聚体的酶上； ：DNA双链被切断，两个亚基以其连接处为铰链转动，张开其靠近DNA断裂点的部分； ：未断的DNA双链穿过切口； ：连接断裂的DNA，以左手方向绕在酶分子上； ：连接好的DNA释放出来。精选pptDNA旋转酶每作用一次产生两个负超螺旋，因此可以消除复制叉向前移动所产生的正超螺旋，并且复制完的两个子代DNA双链的分离也需要DNA旋转酶的催化功能。当加入DNA旋转酶的抑制剂如香豆霉

36、素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixic acid）等时均能抑制细菌DNA的合成。可见DNA旋转酶是DNA复制所必不可少的。精选ppt拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase) 拓扑异构酶拓扑异构酶可使可使DNA双链中的一条双链中的一条链切断，松开双螺链切断，松开双螺旋后再将旋后再将DNA链连链连接起来，从而避免接起来，从而避免出现链的缠绕。出现链的缠绕。拓拓扑异构酶扑异构酶可切断可切断DNA双链，使双链，使DNA的超螺旋松解后，的超螺旋松解后，再将其连接起来。再将其连接起来。大肠杆菌拓朴异构酶大肠杆菌拓朴异构酶的结构的结构精选ppt

37、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)： 拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。 例：大肠杆菌中的DNA旋转酶精选pptDNA旋转酶对真核细胞有丝分裂也是非常重要，如果不解开缠绕，在任何细胞周期中姐妹染色体都将无法分离。此外，DNA旋转酶在转录、同源重组及可移动元件的转座中都起重要作用。 精选ppt三三. .DNADNA解旋酶解旋酶复制过程中，复制叉在不断前进，复制叉前方的亲代DNA就需不断解链，为使复

38、制能够顺利进行，就必须防止DNA单链的链间或链内局部“退火”并保证其完整性与伸展性，使单链DNA处于稳定的状态。承担上述任务是DNA解旋酶（DNA helicase）和单链DNA结合蛋白（single-strand binding protein, SSB）。精选ppt DNA解旋酶是很多细胞过程所要求的（如核苷酸切除修复、同源重组、转录终止）。DNA解旋酶是利用ATP水解获得的能量来打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称（又称解链酶）。原核生物大肠杆菌为DnaB和Rep蛋白，DnaB结合于滞后链模板沿53方向前进，Rep蛋白结合于前导链模板沿35方向移动（图5-

39、7）。精选ppt8、DNA 解螺旋酶 /解链酶（DNA helicase) 通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。reprep蛋白沿蛋白沿3 3 5 5移动，而解螺旋酶移动，而解螺旋酶I I、IIII、IIIIII沿沿5 5 3 3移动。移动。精选pptDNA解链酶解链酶 解链酶或解链酶或rep蛋白，是蛋白，是用于解开用于解开DNA双链的双链的酶蛋白，每解开一对酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在。目前发现存在至少存在两种解链酶。至少存在两种解链酶。 精选ppt真核生物病毒中大T-抗

40、原（T-antigen, T-ag）具解开双链的功能。此外也在一些真核生物中分离纯化出多种DNA解旋酶，其功能还在鉴定证实中。精选ppt 图5-7 DNA双螺旋的解旋精选ppt四. 单链结合蛋白单链结合蛋白单链DNA结合蛋白（SSB），又称螺旋反稳又称螺旋反稳蛋白（蛋白（HDPHDP）。这是一些能够与单链）。这是一些能够与单链DNADNA结合的结合的蛋白质因子。蛋白质因子。在细胞内行使很多涉及单链区域稳定性的功能（如同源重组）。其作用为：其作用为： 使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNADNA单链单链能够稳定存在，即稳定单链能够稳定存在，即稳定单链DNADNA，便于以其为，便于以其为模板复制子

41、代模板复制子代DNADNA； 保护单链保护单链DNADNA，避免核，避免核酸酶的降解。酸酶的降解。精选ppt在复制中，这包括稳定熔解起点，维持解旋酶活性，从DNA模板上去除二级结构以及抑制核酸酶活性。即SSB与DNA单链相结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。在E.coli中SSB为四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲合力。精选ppt它们与DNA结合时有协同作用，即有一个SSB与DNA结合时，就会有更多的SSB迅速结合上去扩展分布整个DNA单链，将DNA包被上蛋白聚合体。SSB有某些碱基组成的

42、倾向性，但很少有顺序专一性结合，可以周而复始地循环使用，在DNA的修复和重组中都有SSB的参与。 精选ppt单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白单链单链DNADNA结合蛋白（结合蛋白（single strand binding single strand binding protein, SSBprotein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（）又称螺旋反稳蛋白（HDPHDP）。）。这是一些能够与单链这是一些能够与单链DNADNA结合的蛋白质因子。结合的蛋白质因子。其作用为：其作用为： 使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNADNA单链能够单链能够稳定存在，即稳定单链稳定存在，即稳定单链DNADNA，

43、便于以其为模板，便于以其为模板复制子代复制子代DNADNA； 保护单链保护单链DNADNA，避免核酸酶，避免核酸酶的降解。的降解。 精选ppt五.引发酶与引物RNA的合成 已经证明，DNA的半不连续复制中，DNA聚合酶不能从头起始新的DNA链合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今为止，人们所发现的引物大多为一段RNA，其长度和序列随着基因组的种类而表现出不同，在大多数情况下为110个核苷酸（表5-3）。精选ppt基因组引物长度主要的引物序列*T7T4174大肠杆菌海胆果蝇多瘤病毒动物151515大约1018大约9大约10大约9pppApCpC/ApN12 (N主要为A和C)pppApCpN3

44、pppAp N04pppAC (N) 710(p) ppA/Gp N7pppA (N) 79pppA/Gp N9末测定 表5-3 DNA复制中滞后链前体片断的RNA引物精选ppt DNA复制中以RNA作引物的实验证据是噬菌体M13的DNA复制对转录抑制剂的敏感性实验提供的，其结果指出RNA可能提供了DNA复制的3端。此外，Reiji等设计的实验也证明RNA引物是DNA复制必须的精选pptReiji等设计的实验即利用含甲苯的缓冲液处理大肠杆菌以提高该菌对外源核苷酸的通透性，然后再以大肠杆菌与-32P脱氧核苷三磷酸（dNTP）和未标记的核糖核苷三磷酸（NTP）的混合物保温，最后从大肠杆菌分离DNA

45、和用稀碱处理。碱性水解发生在3,5-磷酸二酯键的磷酸基与C-5间，这样就使dNTP的放射性磷转移到核糖核苷酸上去（图5-8）。精选ppt结果发现，每一冈崎片段都产生一个RNA-DNA接头，说明DNA的复制是以RNA为引物。 图5-8 RNA引物存在的实验证明 精选ppt 催化RNA引物（RNA primer）合成的酶叫引发酶（primerase）。引发酶识别DNA单链模板特异顺序，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸产生3-OH，为DNA聚合酶起始生成磷酸二酯键提供条件。 合成冈崎片段引物分子的RNA聚合酶与负责RNA转录的RNA聚合酶是完全不同的两种酶类。精选ppt 引物与典型的RNA（如m

46、RNA）不同，它们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。在转录的过程中，RNA分子是RNA聚合酶作用下的产物，合成出的RNA分子会与模板DNA链分离。 在E.coli中合成冈崎片段引物分子的RNA聚合酶由dnaG基因编码，这种RNA聚合酶也称为引发酶（primase）。精选pptE.coli的引发酶是一条肽链，分子量为60 000，每个细胞中有50100个分子。该酶单独存在时是相当不活泼的，只有在与有关蛋白质相互结合成为一个复合体时才有活 性 。 这 种 复 合 体 就 称 为 引 发 体（primasome）。 引物分子为DNA聚合酶合成DNA分子提供了启动聚合的3OH末端。精选p

47、pt机体选择RNA作为引物，其原因可能在于减少致死突变（lethal mutation）。DNA复制中，从模板拷贝最初的几个核苷酸时，由于碱基堆集力很弱，其氢键结合能力也很弱，因而碱基对的错配几率就大很多，加上这几个核苷酸还没有与模板形成稳定的双链结构，DNA聚合酶35校对功能很难发挥作用。精选ppt因此为了保证生物DNA复制的保真度，采用以RNA为引物这种过渡形式，既为DNA聚合酶提供3-羟基端，又容易被 DNA聚合酶识别而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶进行切口平移。切口平移过程中发生错误的几率极少，因为DNA聚合酶（pol I）有35外切核酸酶活性，具有校对功能。精选ppt 无论是前导

48、链还是后随链的引物均为RNA分子，当DNA复制完成后，必须将RNA引物分子降解。 研究证明，相对分子质量为103103的DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理后，C端形成相对分子质量为68103的大片段，N端形成相对分子质量为35103的小片段，大片段具有从5向3方向的聚合DNA功能和从3向5的外切校正功能，但效率较低，也称klenow片段。小片段具有从5向3方向的外切核酸酶功能。精选ppt六六. .DNADNA连接酶连接酶 DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase ) (DNA ligase ) ，1967年发现若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两

49、端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但它不能将两条游离的DNA单链连接起来在在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程中起复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用重要作用精选ppt DNADNA连接酶催化的连接酶催化的条条件件是：是： 需一段需一段DNADNA片段具有片段具有3-OH3-OH，而，而另一段另一段DNADNA片段具有片段具有5-Pi5-Pi基；基； 未封闭未封闭的缺口位于双链的缺口位于双链DNADNA中，即其中有一条链中，即其中有一条链是完整的；是完整的； 需要需要消耗能量，在原核生消耗能量，在原核生物中由物中由NADNAD+ +供能，在供能，在真核生物中由真核生物中由ATPATP供供能

50、。能。精选pptDNA连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶ATP或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链模板链模板链精选ppt 第三节第三节DNA复制过程的总结及其调控复制过程的总结及其调控 DNA复制通常是从双螺旋的特定位置复制原点（ori）开始，一般是富含A-T的区段该区段的双链DNA具有较强的呼吸作用（breathing），是经常瞬间处于打开形成单链的区段（frequently opening region）精选ppt “呼吸呼吸现

51、象现象” DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，复制原点处氢键迅速断裂与再生， 导致两条导致两条DNA链不断解链与聚合，链不断解链与聚合， 形成瞬间的单泡状结构的过程。形成瞬间的单泡状结构的过程。 在富含在富含AT的区域内尤为明显的区域内尤为明显精选ppt由此产生的瞬时单链与SSB蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）结合，对复制的起始十分重要。原核生物的复制原点通常为一个，而真核生物则有多个特定的复制原点。精选ppt依DNA合成的起始方式，复制可分为从新起始与共价延伸两种类型前者是前导链从新开始，也叫复制叉式复制；后者是先导链共价结合在一条亲代链

52、上，也叫滚环式复制。精选ppt复制主要以双向等速进行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的复制；部分是单方向进行，如质粒ColE1的复制；或以不对称的双向方式进行，如线粒体DNA的复制。精选ppt一一. . 复制的起始复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。复制的起始阶段，由下列两步构成。 1.预引发预引发 （ 1）解旋解链，形成复制叉）解旋解链，形成复制叉由拓扑异构酶和解链酶作用，使由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链成两条单链DNA。精选ppt 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（

53、SSB）结合在）结合在两条单链两条单链DNA上，形成复制叉。上，形成复制叉。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为两条单链，这种叉状结构称为复制叉复制叉。 对于双向复制而言，形成的对于双向复制而言，形成的两个复两个复制叉向相反方向行进，制叉向相反方向行进，每个复制叉上的每个复制叉上的两条两条DNA链均被拷贝。链均被拷贝。精选ppt图5-12 复制叉 （箭头表示子链总的生长方向） 精选ppt（2 2）引发体组装：）引发体组装： 由蛋白因子（如由蛋白因子（如dnaBdnaB等）识别复制等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶起始点，并与其他蛋白

54、因子以及引物酶一起组装形成引发体。一起组装形成引发体。 2.2.引发引发在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNADNA为模板，为模板，合成一段短的合成一段短的RNARNA片段，从而获得片段，从而获得33端自端自由羟基（由羟基（3-OH3-OH）。）。 精选ppt DNA半不连续复制的模式说明，双链DNA分子复制起始时从复制原点处DNA分子解链，前导链在一段RNA引物的发动下连续合成的模式完成合成过程，而后随链是按不连续合成的模式不断地完成冈崎片段的合成，而每个冈崎片段都需要有RNA引物的发动过程。 精选ppt RNA聚合酶抑制剂利福平对DNA复制的起始也具有明显抑制效应。但一旦复制的起始

55、过程完成后，利福平的抑制效应也随之消失，表明前导链的RNA引物是由RNA聚合酶合成的。 如同基因转录过程一样，此RNA聚合酶可以使双链DNA分子局部开链。精选ppt RNA聚合酶在合成1012个核苷酸RNA片段之后，再由DNA聚合酶完成前导链DNA合成； 在完成10002000个核苷酸的DNA合成后，后随链才在引发酶的作用下开始冈崎片段的引物RNA的合成。 这一过程也称为DNA复制的转录激活。精选ppt二二复制的延长复制的延长 1.1.聚合子代聚合子代DNADNA由由DNADNA聚合酶催化，以聚合酶催化，以3535方向的亲方向的亲代代DNADNA链为模板，从链为模板，从5353方向聚合子代方向

56、聚合子代DNADNA链。链。在原核生物中，参与在原核生物中，参与DNADNA复制延长的是复制延长的是DNADNA聚合酶聚合酶；在真核生物中，是在真核生物中，是DNADNA聚合酶聚合酶(延长滞后延长滞后链链) )和和（延长前导链）（延长前导链）。精选ppt 精选ppt2.2.引发体移动引发体移动引发体向前移动，解开新的局部双引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，滞后链重新合螺旋，形成新的复制叉，滞后链重新合成成RNARNA引物，继续进行链的延长。引物，继续进行链的延长。 精选ppt精选ppt 三三复制的终止复制的终止 1.1.去除引物，填补缺口去除引物，填补缺口在原核生物中，由在原

57、核生物中，由DNADNA聚合酶聚合酶来水来水解去除解去除RNARNA引物，并由该酶催化延长引物引物，并由该酶催化延长引物缺口处的缺口处的DNADNA，直到剩下最后一个磷酸酯，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。键的缺口。而在真核生物中，而在真核生物中，RNARNA引物的去除，引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由段仍由DNADNA聚合酶来延长。聚合酶来延长。 精选ppt2.2.连接冈崎片段连接冈崎片段 在在DNADNA连接酶的催化下，形成最后一连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的成完整

58、的DNADNA长链。长链。 精选ppt大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体复制的终止复制的终止ori复制叉复制叉2复制叉复制叉1终止复制叉终止复制叉2终止复制叉终止复制叉1复制叉复制叉1复制叉复制叉2完成复制完成复制DNA拓扑异构酶拓扑异构酶连锁染色体连锁染色体精选ppt四染色体多复制子复制的非一致性 原核生物在染色体DNA复制完成之前，复制起始点可以连续发动新一轮的复制起始，表现为多个复制叉的特点。 精选ppt 而真核生物染色体DNA虽多为多复制子，但每一个复制子在一个细胞周期中只启动一次，对每一个复制子来说，无论复制完成得早晚，都必须等待到下一个细胞周期开始后才有可能发动新一轮复制。 精选ppt

59、成千上万个独立的复制子看似在“同一起跑线上”，其实每个复制子发动复制的先后时序有很大的差别。 而且这种时序的差别明显地表现在同一染色体的不同复制子之间，表现在不同类型的细胞之间。 精选ppt 将啤酒酵母中克隆到的复制起点序列（ori）构建成一个环状的DNA分子，再导入到酵母细胞中，发现它可以启动环状的DNA分子自主复制，将这段富含AT碱基并在不同复制子中较为保守的序列称为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）。精选ppt 果蝇受精后可检测处于开放状态的ARS从5000个上升到50000个，发育早起的复制子的长度仅有7.9kb，而发育到成虫时

60、复制子的长度可以增加到40kb，可见此时许多ARS已处于关闭状态。精选ppt 尽管这种调控的机制目前还不甚了解，但复制子变化规律表明，复制子的多少与DNA复制的速度有关，而完成全基因组的复制与细胞、组织及发育状态有关，表现了多复制子复制启动的非一致性。精选ppt五 DNA复制的调控复制的调控 与基因表达调控一样，DNA复制调控的关键环节是起始过程的转录激活效率，同时细菌的培养试验表明，细菌的繁殖速率与营养条件（特别是氨基酸饥饿状态对复制的影响），及多种专一性蛋白因子的浓度密切相关。精选ppt 细菌的严谨型质粒和松弛型质粒，相容性质粒和不相容性质粒之间的差异都表现在复制起始调控上，这种调控机制是自然选择中的先后