细胞核的分离与鉴定

1、实验一：动物细胞融合实验一：动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动 受精作用受精作用两个细胞正在融合两个细胞正在融合动物细胞融合基本过程：动物细胞融合基本过程：诱导方法：诱导方法：诱导方式诱导方式物理法：物理法：化学法：化学法：生物法：生物法： 灭活的病毒灭活的病毒电刺激电刺激聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG 聚乙二醇聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞细

2、胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝凝集作用集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它但是它有一定毒性有一定毒性，对有些细胞，对有些细胞(如卵细胞如卵细胞)不不适用。适用。聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融合诱导融合一、实验目的实验目的 1、了解动物细胞的融合了解动物细胞的融合 2 2、熟悉、熟悉PEGPEG诱导细

3、胞融合的方法诱导细胞融合的方法 3 3、掌握动物细胞融合的基本原理及方法、掌握动物细胞融合的基本原理及方法二、实验原理二、实验原理细胞融合（细胞融合（cell fusion）：）：由两个或多个细胞相互由两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。细胞融合。分分为为细胞自发融合细胞自发融合和和诱导细胞融合。诱导细胞融合。诱导细胞融合（诱导细胞融合（ induced cell fusion） ：指在人指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象。为诱导条件下所发生的细胞融合

4、现象。 1、材料：材料：HeLaHeLa细胞、细胞、CHOCHO细胞、鸡红细胞。细胞、鸡红细胞。 2 2、试剂：聚乙二醇（、试剂：聚乙二醇（PEGPEG，MV=4000MV=4000）HanksHanks液、液、0.25%0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶、RPNI1640RPNI1640培养培养液（含液（含10%10%灭活小牛血清和不含血清的两灭活小牛血清和不含血清的两种）、种）、PBSPBS、0.2%0.2%次甲基蓝染液。次甲基蓝染液。 3 3、仪器设备：显微镜、水浴箱、普通离心、仪器设备：显微镜、水浴箱、普通离心机、高心管、载玻片、盖玻片、酒精灯、机、高心管、载玻片、盖玻片、酒精灯、试管。试管

5、。三、实验试剂及材料三、实验试剂及材料实验选材：实验选材： 本次试验选用鸡的外周血做细胞融合材料本次试验选用鸡的外周血做细胞融合材料, 这是因为这是因为: 1. 鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；别；2. 实验材料便宜、易得，避免了用培养的细胞株实验材料便宜、易得，避免了用培养的细胞株做细胞融合实验材料所耗的实验成本和精力；做细胞融合实验材料所耗的实验成本和精力；3.细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。若细胞内只有一个核，定为未融合细进行鉴别。若细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核

6、，定为融合细胞。胞；有二至多个核，定为融合细胞。四、实验步骤：四、实验步骤： 1、取肝素抗凝的弃血清鸡血0.1ml(本实验是进行同种细胞融合）。 2、将悬液移入离心管中，以800r/min离心78min，倾去上清液，加入810ml Hanks液，再次悬浮细胞，离心洗涤一次，倾去上清液后将离心管倒置与滤纸上，尽量流尽剩余液体（这一步骤很重要，因为残留液体会改变PEG的浓度）。 3、用手指轻弹离心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制备好的50%PEG0.4ml，在37水浴中，于90s内逐滴加入离心管中，边加边振摇离心管，使之与细胞混匀，然后加入810ml Hanks 液，轻轻吸打混匀，在37水浴中静置

7、5min 以稀释PEG。离心弃去上清液后，加入23ml含小牛血清的1640培养液，在37水浴中孵育30min。加入加入810ml810mlHanksHanks常规方法消化常规方法消化制制细胞悬液细胞悬液离心管中离心管中 800r/min800r/min离心离心78min78min倾去上清液倾去上清液再次悬浮细胞再次悬浮细胞离心洗涤一次离心洗涤一次手指轻弹手指轻弹离心管离心管在在3737水浴中水浴中于于90s90s内逐滴入内逐滴入离心管离心管加入加入7-8ml Hanks7-8ml Hanks在在3737水浴中静置水浴中静置5min稀释稀释PEG 齐去上清液齐去上清液在在3737水浴中水浴中卵育

8、卵育3min3min加加2-3ml2-3ml含小牛的含小牛的16401640培养液培养液在在5min 10min 20min5min 10min 20min30min30min去悬液制片去悬液制片用用0.2%0.2%次甲基蓝染色次甲基蓝染色观察观察一瓶已长成一瓶已长成HelaHela细胞细胞或或CHOCHO细胞细胞倾去上清液，倾去上清液，将离心管倒置将离心管倒置于滤纸上于滤纸上吸取吸取50%PEG0.4ml50%PEG0.4ml五、预期结果：五、预期结果： （一）融合过程观察：（一）融合过程观察： 分别于温育分别于温育5min、10min、15min、20min、30min取细胞悬液一滴制成临

9、时装取细胞悬液一滴制成临时装片，以片，以0.2%次甲基蓝染液染色，在显微镜次甲基蓝染液染色，在显微镜下观察细胞融合的不同阶段，通常可把融下观察细胞融合的不同阶段，通常可把融合过程大致分为合过程大致分为5个阶段：个阶段：五个阶段五个阶段两个细胞的膜相互接触，粘连。两个细胞的膜相互接触，粘连。相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道。相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道。两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道。两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道。通道扩大，两细胞连成一体。通道扩大，两细胞连成一体。细胞合并完成，形成一个含有两个或多个细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。核的圆形细胞。 （注

10、：上述阶段可在不同时期观察）（注：上述阶段可在不同时期观察）细胞融合过程图六、注意事项：六、注意事项： 1 1、制备的、制备的50%PEG50%PEG一定要保存于一定要保存于3737水浴中，水浴中，不然冷却后结晶析出。不然冷却后结晶析出。 2 2、在理想管中加、在理想管中加PEGPEG之前，一定要将离心之前，一定要将离心管倒置于滤纸上，流尽剩余液体，否则残管倒置于滤纸上，流尽剩余液体，否则残留液会改变留液会改变PEGPEG的浓度。的浓度。 3.3.操作规范，防止试剂污染。操作规范，防止试剂污染。 4.4.细胞悬液的涂片制作要轻柔。细胞悬液的涂片制作要轻柔。 5.5.使用离心机要注意平衡，转速从

11、低到高。使用离心机要注意平衡，转速从低到高。一、实验目的一、实验目的1 掌握分离细胞核的原理掌握分离细胞核的原理2 熟悉细胞核的鉴定方法熟悉细胞核的鉴定方法3 了解细胞核的分离过程了解细胞核的分离过程4 掌握离心机的正确使用方法掌握离心机的正确使用方法实验二：细胞核的分离和鉴定实验二：细胞核的分离和鉴定二、实验原理二、实验原理 细胞核的结构是由核膜、染色质、核仁和细胞核的结构是由核膜、染色质、核仁和核基质构成核基质构成,细胞核的比重和大小与细胞内细胞核的比重和大小与细胞内其他组分不同，在同一离心场内其沉降速其他组分不同，在同一离心场内其沉降速度也不同，所以常用不同介质的离心力离度也不同，所以常

12、用不同介质的离心力离心心(差数离心），将细胞各细胞器和组分分差数离心），将细胞各细胞器和组分分级分离出来。再运用细胞化学法进行鉴定级分离出来。再运用细胞化学法进行鉴定.三、试验器材及试剂三、试验器材及试剂 器材：器材：光学显微镜、离心机、离心管、天 平、镊子、载玻片、盖玻片、染色盘架、纱布、解剖剪、玻璃漏斗、25ml烧杯、量筒、滴管、玻璃匀浆器 试剂：试剂：1%甲烯兰染液 生理盐水 缓冲液：0.25ml蔗糖 3mmolMgCl2 0.5TritonX-100 0.5TritonX-100 10mmol Tris-HCl pH=7.9 缓冲液：1mol蔗糖 3mmolMgCl2 1TritonX

13、-100 材料：材料：家兔肝细胞四、实验步骤：四、实验步骤：1、 断脊柱法断脊柱法处死家兔，迅速开腹取肝，在盛有生理处死家兔，迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤。盐水的小烧杯中反复洗涤。2、称取湿重约、称取湿重约1g的肝组织，量取的肝组织，量取8ml预冷的匀浆缓冲预冷的匀浆缓冲液（液（0.25mol/L蔗糖蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液）并加氯化钙溶液）并加入烧杯中，尽量剪碎肝组织。入烧杯中，尽量剪碎肝组织。3、匀浆彻底后，样品夜、匀浆彻底后，样品夜4层纱布过滤层纱布过滤（先用少量匀浆（先用少量匀浆缓冲液润湿纱布）缓冲液润湿纱布）后静置后静置5min,弃去沉渣，滤液转弃去沉渣，滤液转移至玻璃离心管中。移至玻璃离心管中。4、平衡离心管，离心、平衡离心管，离心10min(1000r/min)后后,将上清液将上清液经经8层纱布过滤。再用足量的缓冲液层纱布过滤。再用足量的缓冲液悬浮沉淀。悬浮沉淀。6、取以上得到的溶液制一张涂片，自然干燥。用、取以上得到的溶液制一张涂片，自然干燥。用1甲烯兰染液对涂片进行染色。甲烯兰染液对涂片进行染色。5、在另一只离心管中先加入、在另一只离心管中先加入1/3体积的缓冲液体积的缓冲液，在家以，在家以上悬浮液加入管内缓冲液上（不要混匀），然后将其以离上悬浮液加入管内缓冲液上（不要混匀），然后将其以离心心10min(1000r/min)。7、冲