季的花药培养(定稿)

1、授课教师：李琳授课教师：李琳 植物的花药培养和单倍体育种的关系植物的花药培养和单倍体育种的关系花粉粒（花粉粒（1N）单倍体植株单倍体植株（1N）二倍体纯合子二倍体纯合子植株（植株（2N）花药离体培养花药离体培养人工诱导染色体数加倍人工诱导染色体数加倍花的结构花的结构花丝花丝花药：花药：囊状结构，内有很多花粉囊状结构，内有很多花粉 花粉是由花粉母细胞（即小孢子母细胞）花粉是由花粉母细胞（即小孢子母细胞）经过经过而形成的，因此，花粉是而形成的，因此，花粉是。 花粉的发育要经历：花粉的发育要经历：时期、单核时期、单核期、双核期期、双核期等阶段。等阶段。雄蕊雄蕊被子植物花粉的发育过程被子植物花粉的发育

2、过程四分体四分体时期时期单核期单核期双核期双核期1花粉母花粉母细胞（细胞（2n）4个小孢子个小孢子(小孢子小孢子四分体四分体)（n）减分减分有分有分1个花粉管细胞核（个花粉管细胞核（n）1个生殖细胞核（个生殖细胞核（n）有分有分2个精子个精子单核居中期（单核居中期（n）单核靠边期（单核靠边期（n）注意： 二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉花粉管细胞核和生殖细胞核管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中。（精子在花粉管中形成）形成） 三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，生殖细胞进行一次

3、有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两一个营养核和两个精子。个精子。 两个精子和一个营养核的两个精子和一个营养核的基因型基因型相同。相同。移栽移栽花药中花药中的花粉的花粉胚状体胚状体脱分化脱分化 愈伤组织愈伤组织 花药中花药中的花粉的花粉脱分化脱分化 分化分化 丛芽丛芽 再分化再分化 丛芽丛芽 诱导诱导生根生根体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些细胞在形态上转体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与变为与合子发育成的胚非常相似的结构合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类，发育过程亦与合子胚类似似这两种途径之

4、间没有绝对的界限，这两种途径之间没有绝对的界限，主要取主要取决于培养基中激素的种类及浓度配比。决于培养基中激素的种类及浓度配比。1、材料的选择、材料的选择 不同植物的诱导成功率不同不同植物的诱导成功率不同. 同一植物亲本的不同生理状况也对诱导成功率有直同一植物亲本的不同生理状况也对诱导成功率有直接的影响接的影响. 合适的花粉发育期（单核居中期与靠边期之间）合适的花粉发育期（单核居中期与靠边期之间）(三三)、影响花药培养的主要因素、影响花药培养的主要因素 材料的选择与培养基的组成材料的选择与培养基的组成从花药看：月季的初花期从花药看：月季的初花期（五月初到五月中旬）（五月初到五月中旬）从花粉看：

5、单核期从花粉看：单核期（一般来说，细胞核核从中央移向（一般来说，细胞核核从中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高）细胞一侧的时期，花药培养成功率最高）从花蕾看：完全未开放的从花蕾看：完全未开放的 此外，植株生长条件、材料低温预处理、接种密度等对此外，植株生长条件、材料低温预处理、接种密度等对诱导成功率有一定影响。诱导成功率有一定影响。2、培养基的组成、培养基的组成（ MS培养基培养基+不同比例的植物生长调节激素）不同比例的植物生长调节激素）实验操作实验操作材料选取材料选取材料和材料和消毒消毒接种和接种和培养培养实验操作实验操作（一）材料选取（一）材料选取 通过通过镜检镜检来确定是否处于适宜

6、的发育期。来确定是否处于适宜的发育期。 方法：方法：醋酸洋红法醋酸洋红法(将染色体染成红色将染色体染成红色) 对于某些植物的花粉细胞核不易着色使用对于某些植物的花粉细胞核不易着色使用 焙花青焙花青-铬矾法铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色花粉细胞核染成蓝黑色)。 从花药看：月季的初花期从花药看：月季的初花期 从花粉看：单核期从花粉看：单核期 从花蕾看：完全未开放的从花蕾看：完全未开放的 1.我们怎样选择想要的花粉呢？我们怎样选择想要的花粉呢？2.我们怎样保证所选的材料处于单核期？我们怎样保证所选的材料处于单核期？为什么花瓣松动会给材料的为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？消毒带来困难？答：花瓣松动

7、后，微生物就答：花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。的消毒带来困难。（二）材料的消毒（二）材料的消毒5 5、无菌水冲洗、无菌水冲洗3 35 5次次 花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用、花蕾用体积分数为体积分数为70%的酒精的酒精浸泡浸泡30秒秒2、无菌水清洗、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4、放入、放入质量分数为质量分数为0.1%的氯化汞的氯化汞溶液中溶液中24分钟分钟 （质量分数为质量分数为1%的的次氯酸钙溶液次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液或饱和

8、漂白粉溶液）花花蕾蕾（70酒精）酒精）大约大约30s（无（无菌水）菌水）清洗清洗（无菌（无菌吸水纸）吸水纸）吸干水吸干水分分（1氯化氯化汞溶液）汞溶液）24min（无（无菌水）菌水）冲洗冲洗 月季花蕾的消毒与菊花外植体的消月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，二者有何不同？毒相比较，二者有何不同？ 在酒精消毒前，花药不需要预先用流在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗 （三）接种和培养（三）接种和培养 灭菌后花蕾，要在灭菌后花蕾，要在无菌条件无菌条件下除去萼片和下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。花瓣，并立即将花药接种到培养基上。

9、在剥离花药时，要尽量在剥离花药时，要尽量不损伤花药不损伤花药（否则否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织织），同时还要彻底），同时还要彻底去除花丝去除花丝，因为与花丝相连因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。 通常每瓶通常每瓶接种花药接种花药7-107-10个个，温度控制在，温度控制在2525左右，左右，不需要光照不需要光照。幼小植株形成后才。幼小植株形成后才需要需要光照。光照。 一般经过一般经过20-3020-30天培养后，会发现花药开裂，天培养后，会发现花药开裂，长出长出愈伤组织或释放出胚状体愈伤

10、组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时。将愈伤组织及时转移到转移到分化培养基分化培养基上，以便进一步分化出再生植上，以便进一步分化出再生植株。株。 如果花药开裂释放出如果花药开裂释放出胚状体胚状体，则一个花，则一个花药内就会产生药内就会产生大量幼小植株大量幼小植株，必须在花药开必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上培养基上，否则这些植株将很难分开。，否则这些植株将很难分开。 在花药培养中，特别是通过愈伤组织形在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变染色体倍性的变化。化。因此还需要因此还

11、需要对培养出来的幼苗进一步的对培养出来的幼苗进一步的鉴定和筛选。鉴定和筛选。（三）、接种和培养（三）、接种和培养1、剥取花药、剥取花药2 2、接种花药、接种花药3 3、培养、培养4 4、分化培养基培养、分化培养基培养5 5、鉴定和筛选、鉴定和筛选不要损伤花药？不要损伤花药？要彻底除去花丝？要彻底除去花丝？常常会出现染色体倍性的变化？常常会出现染色体倍性的变化？ 每个培养瓶接种（每个培养瓶接种（7 710 10 ）个花药？）个花药？花药长出愈伤组织还要转移到哪？花药长出愈伤组织还要转移到哪？主要原因是主要原因是营养核和生营养核和生殖核融合殖核融合造造成的成的植物组织培养技术与花药培养技术的比较植

12、物组织培养技术与花药培养技术的比较项目项目植物组织培养植物组织培养花药培养技术花药培养技术相同点相同点1 1 培养基配制方法、无菌技术及接种操作培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。等基本相同。2 2 都经过了脱分化都经过了脱分化不同点不同点1 1 离体培养的外植离体培养的外植体为体为体细胞。体细胞。2 2 有丝分裂的过程，有丝分裂的过程，染色体数量不变。染色体数量不变。1 1 花粉是花粉是生殖细胞生殖细胞，得，得到的到的单倍体植株单倍体植株，弱小，弱小且高度不育。且高度不育。2 2秋水仙素处理，染色秋水仙素处理，染色体加倍，恢复正常的染体加倍，恢复正常的染色体数，为色体数，为。 （四

13、）结果分析与评价（四）结果分析与评价选材是否恰当：选材是否恰当：选材时实验成功的关键。要选材时实验成功的关键。要能通过镜检找到适宜发育期的花粉。能通过镜检找到适宜发育期的花粉。无菌技术是否过关：无菌技术是否过关：如果出现了污染现象，如果出现了污染现象，说明某些技术操作步骤，如培养基灭菌、花蕾说明某些技术操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。消毒或接种等有问题。接种是否成功：接种是否成功：如果接种的花药长出愈伤组如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状了。要适时转换培养基，以便愈伤组

14、织或胚状体进一步分化成再生植株。体进一步分化成再生植株。(08(08年海南高考年海南高考) )某二倍体植物是杂合体，图为其花药中未成熟某二倍体植物是杂合体，图为其花药中未成熟花粉在适宜的培养基上培养产生完整植株的过程。据图回答：花粉在适宜的培养基上培养产生完整植株的过程。据图回答： （1）图中）图中表示的是该花粉培养过程中的表示的是该花粉培养过程中的 _过程，过程，表表示的是示的是_过程，过程，X代表的是代表的是_，表示的是表示的是_ 过过程，程，表示的是诱导表示的是诱导_ 过程。过程。（2）图中从愈伤组织形成完整植株的途径有两条，具体通过那）图中从愈伤组织形成完整植株的途径有两条，具体通过那

15、一条途径主要取决于培养基成分中一条途径主要取决于培养基成分中_ 的种类及其浓度的种类及其浓度配比，最后获得的来源于为成熟花粉的完整植株都称为配比，最后获得的来源于为成熟花粉的完整植株都称为 _ 植株（甲）。未成熟花粉经培养能形成完整植株，说明为成熟植株（甲）。未成熟花粉经培养能形成完整植株，说明为成熟花粉具有花粉具有_。脱分化脱分化再分化再分化胚状体胚状体分化分化生根生根激素激素单倍体单倍体细胞全能性细胞全能性（0909广州综合测试）下图是月季花药离体培养产广州综合测试）下图是月季花药离体培养产生花粉植株的两种途径，请据图回答有关问题：生花粉植株的两种途径，请据图回答有关问题：1 1）选用的材

16、料合适与否是成功诱导出花粉植株的）选用的材料合适与否是成功诱导出花粉植株的重要因素，一般来说选用重要因素，一般来说选用 期的花粉可提高成期的花粉可提高成功率。选择花粉时，一般要通过功率。选择花粉时，一般要通过 来确定花粉是否处于合适的发育期，这时需要来确定花粉是否处于合适的发育期，这时需要对花粉的细胞核进行染色，常用的染色剂是对花粉的细胞核进行染色，常用的染色剂是 。单核单核镜检（显微镜观察）镜检（显微镜观察）醋酸洋红醋酸洋红2 2）上图中花药经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取）上图中花药经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取决于培养基中决于培养基中 。3 3）胚状体与愈伤组织在结构上的主要区

17、别在于愈伤组织）胚状体与愈伤组织在结构上的主要区别在于愈伤组织的细胞排列疏松无规则，是一种高度的细胞排列疏松无规则，是一种高度 的薄壁细胞，胚状体与的薄壁细胞，胚状体与 发育形成的胚有发育形成的胚有类似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。类似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。4 4）无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，请说）无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，请说明下列各项需要消毒，还是需要灭菌。明下列各项需要消毒，还是需要灭菌。培养基，培养基，培养皿，培养皿，接种环，接种环，花蕾，花蕾，实验实验操作者的双手，操作者的双手，三角锥形瓶。三角锥形瓶。 （填编号）（填编号）需要灭菌，需要灭菌

18、， （填编号）需要消毒。（填编号）需要消毒。激素的种类及其浓度配比激素的种类及其浓度配比液泡化液泡化正常受精卵正常受精卵 基因型为基因型为AaBb的水稻（条染色体）的花药通的水稻（条染色体）的花药通过无菌操作，接入试管后，在一定条件下培养成试管过无菌操作，接入试管后，在一定条件下培养成试管苗。苗。（）愈伤组织是花粉细胞分裂形成的不规则的细胞（）愈伤组织是花粉细胞分裂形成的不规则的细胞团，愈伤组织必须从培养基中获得（）（团，愈伤组织必须从培养基中获得（）（ ）和小分子有机物等营养物质。和小分子有机物等营养物质。（）要促进花粉细胞的分裂分化，培养基中应有（）要促进花粉细胞的分裂分化，培养基中应有（ ）（）（ ）两种激素。）两种激素。愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，由芽发育成愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，由芽发育成叶茎。这一过程必须给予光照，其原因是（）叶茎。这一过程必须给予光照，其原因是（）利用光能制造有机物促进试管苗生长发育。利用光能制造有机物促进试管苗生长发育。（）试管苗的细胞核中有（）条脱氧核苷酸（）试管苗的细胞核中有（）条脱氧核苷酸链。试管苗的基因型有：链。试管苗的基因型有： 水水无机盐无机盐生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素叶叶24AB Ab aB