微生物限度检查若干问题

1、.微生物限度检查若干问题微生物限度检查若干问题微生物限度检查是对非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，是药品微生物学检验的重要内容之一。中国药典 2000 年版二部附录 J“微生物限度检查法 ”、中国药品检验标准操作规范（2000年版）及参考书药品微生物学检验手册均做了详尽的阐述。下面对几个比较重要的问题，谈一点工作学习体会，仅供参考。一、实验室要求开展微生物限度检查工作，首先要按照药品检验所实验室质量管理规范及药品生产质量管理规范的要求，建立一个布局合理，使用方便，操作安全的实验室，并且配有完善的实验设施和管理制度。微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物检定实验室以及接

2、种室（接种对照菌及菌种传代）均应严格分开。（一）无菌室：1 结构与要求：最好设在二楼以上（防潮、防霉、采光好），面积不超过10 平方米，高度不超过 24 米，由 2 个缓冲间和操作间组成。缓冲间与操作间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙、无死角。无菌室内光照应不低于300 勒克斯，缓冲间和操作间均应装有紫外线'.杀菌灯 2-25w/m3 作空气消毒用。 紫外线波长 200-300nm 者''具有杀菌作用，其中以 265-266nm 最强，这与 DNA 的吸收光谱范围

3、一致。 其杀菌机理可能是在 DNA 中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰DNA 复制，导致细菌变异或死亡。紫外线杀菌灯1m 以内距离杀菌效果最佳 ''每次开灯照射时间为20min。其缺点：穿透力弱，一张纸可以挡住，不能穿透固体物，对人的皮肤眼睛有损伤，所以紫外线灯开关应装在无菌室外便于开关。2 温度、湿度：温度应控制在18-26''相对湿度 40-60''操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正比''不低于 49Pa。3 操作间：应安装空气除菌过滤层流装置，操作间不应安装下水道，洁净度不低于 1 万级，净化工作台局部应为100

4、 级。操作间应准备电子称 （感量 01g''最大称量 300g''乙醇灯 ''火柴 ''2 碘酊及 75 乙醇棉球，大、小橡皮乳头，记号笔，灭菌的剪刀，镊子、注射器等。4 缓冲间：应有洗手盒、消毒液、无菌衣、帽、口罩，拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物。（二）洁净级别及检查方法：通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。98 年国家药监局颁布药品生产质量管理规范''把药品生产洁净区空气洁净度划分为四个级别：空气洁净度级别表尘埃数 /立方米活微生物数个洁净级别 '. 05 m 5m浮游菌 /立方米沉降菌 /皿1

5、00 级35000511 万级 35万 2000100310 万级 350万2万50010尘埃数：用尘埃粒子计数器测定，取样高度离地面1 米，间距 05-2 米''每个测试点连续采样3-5 次，仪器显示结果。沉降菌数测定：无菌室及净化工作台面消毒擦拭后，先启动层流净化装置 30min，将营养琼脂平板 3 个及改良马丁琼脂平板 3 个直径 9cm，置净化台左、中、右各 1 个''开盖，暴露 30min 后将盖盖上。分别在 30-35培养 48h 及 25-28培养 72h''细菌和真菌总数不超过 1 个为 100 级。无菌室应在每次操作前后均用01

6、 苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭台面及紫外线照射不到可能污染的死角；用消毒液湿拖地面。实验室一旦被污染''洁净度达不到要求 ''可以清洗或更换净化工作台过滤器 ''甲醛或丙二醇 '' 乳酸熏蒸消毒 ''方法：支架上放一个烧杯（内装少许甲醛， 8ml/ 平方米 ''下面放一个装有少许乙醇的乙醇灯点燃后，关闭门窗，乙醇用尽后灯自灭，甲醛蒸气充满无菌室，密闭24h。缺点：甲醛蒸气易锈蚀仪器，对人有刺激，可用氨水中和，减少对人眼的刺激。二、无菌操作指在无菌的环境条件下，使用无菌的器材，防止微生物污染的操作技&

7、#39;.术。从事微生物检验的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识培训，才具备上岗操作的资格。所用的物品需清洗、干燥、包扎，无菌。干烤箱 1602h''适用于培养皿 9cm、试管、吸管、锥形管、剪刀、镊子物品的灭菌；培养基及 09 氯化钠溶液用高压锅湿热灭菌 ''含糖培养基一般用 11330min''以防温度过高成分被破坏；一般培养基 11530min;09 氯化钠溶液可用 12120min 即可。操作者在缓冲间换拖鞋，用肥皂洗手后，穿戴无菌工作服、帽、口罩，操作前用 01 苯扎溴铵泡手 ''75 乙醇棉球擦拭双手后 &

8、#39;'在乙醇灯火焰区操作。操作中切勿用嘴直接吸吹吸管防止致病菌感染操作人员及口中的杂菌污染供试品。三、药品微生物检验的特点（一）活体易变性：被污染的供试品中活的微生物具有繁殖能力，如细菌以二分裂法无性繁殖， 20 分钟繁殖一代， 一个细菌 10 个小时后可变成 10 亿个细菌。如糖浆剂细菌数标准为 100 个/ml，出厂时检验结果合格，由于贮存不当，放置一段时间成为不合格药品，由于营养成分耗尽细菌自身代谢产物所致的毒性或pH 值改变 ''细菌逐渐死亡，又成为合格药品。（二）分布不匀：由于生产环节多，从原料、中介体到成品，经过生产多个流程，与不同操作人员接触，特别是生

9、产后期被污染，通常是局部的，药品微生物的污染存在着不均性。要求：随机取样，二个包装以上，操作前，供试品摇匀后取样。（三）受损状态：药品中污染的微生物，受到加工、加热过程的机械损伤，药品本身的抑菌杀菌作用，处于受损抑制状态，检验时必须创造适'.宜的生长环境（培养基的营养、 pH 值等）使细菌复苏，从而提高检出率。如口服制剂，必须检查控制菌大肠杆菌， 取 1:10 的供试液 10ml 加入胆盐乳糖增菌液中，胆盐乳糖增菌液是分离大肠杆菌的选择培养基，蛋白胨乳糖等成分提供氮源碳源外，胆盐是抑菌剂，对革兰阳性菌有良好的抑菌作用，从而使目的菌更好地生长。（四）生态环境多样复杂性：药品的种类、剂型繁

10、多，使污染的微生物生态环境多样而复杂。故对不同的供试品分别采用不同的方法，正确地制备供试液，使药品中污染的微生物得以真实反映，是保证检验结果正确可靠的重要前提条件。四、供试液的制备：将供试品制成供试液（一般为 1:10），有利于供试品中污染的微生物分散，与培养基充分接触，提高阳性检出率。常用稀释剂为 09 无菌氯化钠溶液，滴眼剂、王浆、蜂蜜制剂可直接用供试品（原液），作为供试液。在作 10 倍递增稀释时，吸管插入第1 级稀释液内不低于25cm，上下反复吸吹约 10 次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度， 再沿第 2 级稀释管的内壁在液面上1cm处缓

11、慢吹出全部液体。每个稀释级需更换吸管。（一）一般供试品供试液的制备：1 液体制剂：糖浆剂等取样 10ml 至含有玻璃珠的锥形瓶内，加入 09 无菌氯化钠溶液 90ml1:10 的供试液。油剂：取样 10ml''加聚山梨酯 -805ml'' 再加稀释剂至 100ml。不提倡将稀释剂定量分装后再灭菌， 因高压灭菌易使'.液体蒸发损失。2 固体制剂：片剂：称样 10g 至研钵量取稀释剂100ml，先加 10ml 浸没样品，研磨，将上层液倒入锥形瓶，再加少许稀释剂研磨，同上操作直至样品全部研细制成 1:10 的供试液。丸剂及锭剂：中药蜜丸取4 丸以上剪碎后称样1

12、0g''放置匀浆仪专用的不锈钢匀浆杯内， 加入稀释剂 100ml，3000 转/分''2min 制成 1:10 的供试液。胶囊：硬、软胶囊，称样 10g，加入稀释剂 100ml''放 45水浴 10 分钟后振摇 ''使溶解。肠溶片（胶囊）、稀释剂用无菌磷酸盐缓冲液pH68100ml。茶剂：称样 10g 加稀释剂 100ml 浸泡 30min，用无菌纱布过滤取滤液（1:10 的供试液。袋泡茶取 2 袋称量 ''加稀释剂配成 1:10 浸泡 30min。胶剂：如阿胶，先放4冰箱 1h''取出后立即称样1

13、0g，放入匀浆仪内捣碎或用无菌的不锈钢捣罐捣碎，放45水浴促溶。气雾剂：不含抛射剂的可拧开取样10ml，加稀释剂 90ml1:10 含抛射剂，需先放 4冰箱 1h 减压，然后用无菌钢锥钻孔（勿拨出钢锥），转动钢锥使抛射剂徐徐抛出，再用无菌注射器抽出全部药液，然后按标示量用稀释剂补足为原液，以下操作同液体制剂。乳膏剂：称样 10g，加聚山梨酯 -805ml 促溶 ''加稀释剂至 100ml。非水溶性供试品：司盘单硬脂酸甘油酯法：眼膏、软膏剂，以凡士林为基质，不溶于水需加乳化剂使供试品乳化。用减量法称样5g，加入含'.已灭菌溶化并保温 45左右的司盘 -805g、单硬脂酸甘

14、油酯 3g、聚山梨酯 -8010g 混合物的烧杯中，在 45水浴中振摇使供试品中凡士林基质乳化 '' 慢慢加入 45左右的 09 无菌氯化钠溶液 85ml''边加边振摇制成 1:20 供试液。（二）抑菌性供试品供试液的制备抑菌及抗菌性药品，如抗生素、沙星类，既然有抑菌杀菌作用，为什么还要做微生物限度检查，其原因是：被污染的微生物在抗菌药品中因生存环境不利，呈休眠受损状态，但未死亡，一旦用于人体，当条件改变或适宜时，便复苏仍可生长繁殖，对人体造成危害。有的耐药性致病菌株可成为对该抗菌药的依赖株。抗细菌的药品，不能抗真菌，所以可能被真菌污染；抗真菌的药品不能抗细菌，

15、所以可能被细菌污染，故2000 年版药典要求口服抗生素抗细菌的药品检查真菌，抗真菌的药品检查细菌。细菌数及真菌数的测定，供试品未经特殊处理，因三级稀释，基本上可起到稀释后消除抑菌成分的作用。1 稀释法：取 1:10 的供试液 10ml 加入增菌液在 200ml 以上2 沉降法：制成 1:10 的供试液摇匀后静置10min，使药品中污染的微生物混悬于供试液中，难溶于水的抑菌成分自然沉降在容器底层，吸取上层液 10ml 至增菌液。1、 2 法适合于抑菌性弱的药品。3 薄膜过滤法：由于细菌的直径约1m''利用 045m微孔滤膜阻截细菌，滤除抑菌成分，冲洗膜上残留抑菌成分，达到消除抑菌

16、成分之目的。如氯'.霉素滴眼液，取1:10 的供试液 40ml，通过直径为50mm 装有 045m孔径微孔滤膜的无菌滤器，过滤后用 09 无菌氯化钠溶液冲洗，冲洗量约 1000ml，无菌手续取出滤膜放至无菌平皿内，剪成四等份，各取一片分别放置营养内汤增菌液二瓶（其中一瓶加入金黄色葡萄球菌50-100 个及胆盐乳糖增菌液二瓶其中一瓶加入铜绿假单胞菌50-100 个。同时做阴性对照（加稀释剂10ml）。凡士林基质的眼膏、软膏减量法称样 10g，加十四烷酸异丙酯20ml''摇匀 ''使凡士林基质溶解后徐徐加入09 无菌氯化钠溶液80ml1:10 边加边摇 &#

17、39;'静置 ''待分层 ''取水层 20ml 加稀释剂至 100ml，过滤，冲洗（量 1500ml''剪膜操作同上。4 离心沉淀法：利用供试品药物颗粒及细菌不同物质质量的差异，在离心力的作用下达到分离的目的。一次离心法：取1:10 的供试液 20ml 分别放至二支尖底离心管内各10ml，其中一支管内加入阳性对照菌50-100 个''3000 转/分''5 分钟，弃去上层可溶性抑菌成分。二次离心法：操作同上，第一次离心500 转/分， 3 分钟 ''弃去沉淀药渣及不溶性抑菌成分 ;第二次离心

18、 3000 转/分''5 分钟 ''弃去上层可溶性属抑菌成分''取沉淀物约 05ml 加至增菌液中。5 中和法：如磺胺类药品， 1:10 的供试液摇匀后，先用沉降法，弃去沉淀（因磺胺药几乎不溶于水，沉于管底，污染菌在稀释剂中），取上层液10ml 加入含 1 对氨基苯甲酸 05ml 的增菌培养基中，即可中和磺胺类药的抑菌作用。'.对于复方磺胺制剂，需上法与薄膜过滤法联合应用方能奏效。五、结果判断：特殊情况的处理方法1 延长培养时间，菌落极小，不易辨认，可延长培养至4-7 天。乙醇提取的制剂，可延长培养时间再计数。2 排除药物颗粒：药物颗粒及

19、培养基沉淀物、气泡、乳化剂等会影响结果判断，处理方法：多倾注平皿，放冰箱（勿冷冻），对照看结果。配制无菌 1TTC 氯化三苯四氮唑溶液， 营养琼脂 400ml 加 1TTC04ml混匀 ''浇平皿 ''细菌颜色呈红色 ''易辨认。3 不能作为计数依据：二个平皿菌落15 个 ''二个平皿菌数相差1 倍以上二个平皿菌落 15个''二个平皿之间菌落不在0-4''1-7''2-9''3-10''4-12''5-14''6-15。

20、片状菌落无法计算。4 防止片状菌落形成 :营养琼脂中加入1TTC 见上换新近干烤灭菌陶瓦盖''倒置培养待琼脂凝固后 ''平皿倒置斜放净化台上 ''吹 1h5 特殊情况报数 :营养琼脂平皿玫瑰红钠琼脂平皿计数'.有细菌、真菌生长不生长以前者计数不生长有细菌真菌生长以后者计数有细菌、真菌生长有细菌真菌生长以长菌多的平皿计数不能两种平皿同时计一种菌6 培养基稀释法当高稀释级菌数比低稀释级菌数多，有抑菌现象：菌数不规则时可采用此法。取 1:10 供试液三份 ''每份 1ml''分别注入 5 个平皿每个平皿 02ml

21、，倾注营养琼脂，混匀，凝固后，倒置培养，计数， 5 个平皿点计的菌落数之和即为每 1ml 菌落数。三份共15 个平皿，每个平皿加入02ml 供试液。1:10 菌落计数12345X计算： 209/3696 个/ml ×稀释倍数 696 报数 700 个/gml六菌种的保藏：'.菌种保藏是微生物学基础工作中的一项重要内容，用人工方法低温干燥，缺氧等抑制微生物的代谢，以达到保种。保持菌种原有的各种生物学特性，不变异，不污染的目的。国内药品微生物检验所用的菌种是 CMCCB'' 即医学微生物菌种保藏管理中心 BBacteria 代表细菌 ''FFung

22、i 代表真菌。方法：琼脂斜面：将营养琼脂培养基内按05 加入琼脂粉配制，用于细菌接种传代，硅胶橡皮塞塞紧，放4冰箱保存， 2-3 个月传一次。半固体琼脂：营养肉汤培养基内按05 加入琼脂粉配制 ''穿刺接种 ''置冰箱保存 ''6-12 个月传一次。真菌琼脂斜面蛋白胨 5g酵血浸出粉 2g葡萄糖 20g磷酸氢二钾 1g硫酸镁 05g琼脂粉 10g水 1000ml如白色念珠菌 10231，划线接种后， 置 2025培养 24h。3-6 个月传一次。沙氏琼脂斜面 :用于真菌传代蛋白胨 10g葡萄糖 10g琼脂粉 10g'.水 1000ml40

23、 甘油水 接种细菌培养后，放冰箱保存， 12 月传 1 次。需气菌、厌气菌培养基：生孢梭菌 CMCCB64941 菌液取 01ml 至需气菌、厌气菌培养基15ml''在 30-35培养 18-24h。菌种应由专人保管 ''菌种的购入、 传代、使用销毁等均应有记录。 定期检查、分离、纯化以防菌种变异及衰退。七、细菌计数方法：10 倍递增稀释：用接种环取斜面菌苔少许，接种至营养肉汤2ml''培养后为菌原液 ''取 10 支试管，每管装稀释剂 9ml'' 取菌原液 1ml 至第一管与 9ml 稀释剂混匀为 1:10''依次稀释。如取 10-601ml 在营养琼脂平皿上划线培养计数。二管法：取二支试管，管内装稀释剂 5ml''用接种环直径 3mm，取一环菌原液至第一管 ''摇匀，烧接种环，从第一管再取一环至第二管，混匀，从第二管取 01ml 为 50-100 个菌。（可