农杆菌介导的植物转基因技术实验指导

1、农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理； 掌握农杆菌介导转化植 物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化 性地感染大多数双子叶植物的受伤部位， 并诱导产生冠瘿瘤。 农杆菌通过侵染植 物伤口进入细胞后，可将 T-DNA 插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天 然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的 T-DNA 区，借助农 杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技

2、 术，再生出转基因植株。实验一 培养基配制一、仪器和试剂1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台2、药品：Beef extract （牛肉浸膏）5g/L , Yeast extract 酵母提取物）1g/L , Peptone （蛋白胨） 5g/L ， Sucrose （蔗糖） 5g/L ， MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ， Agar （琼脂） 1.5g/100ml, MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA （萘乙酸）,6-BA （6-苄氨 基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。二、实验方法第一组配制 YEB 固体培养基1、配制 250mlYEB 固体培养基

3、： 先称取 1.25g Beef extract （牛肉浸膏）；1 .25gPeptone 蛋白胨）；0.25g Yeast extract 酵母提取物）；1.25g Sucrose 蔗糖）；1g MgSO4.7H2O;琼脂粉3.75g；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml 蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至 250ml，用NaOH调pH=7.4。2、灭菌：将盛有 250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名 称，用高压灭菌锅进行灭菌。3、 抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到 50-60C时（手可触摸） 加入已经过滤好的抗生素（100卩g/mlkan+50卩

4、g/ml St叶50卩g/ml rif），以免温度过高 导致抗生素失效。4、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒 15ml 培养基，可以倒 16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照 10mi n,等待培养基凝固，盖上平 皿盖，封口备用。第二组配制 YEB 液体培养基1、配制 500mlYEB 液体培养基：先称取 2.5g Beef extract （牛肉浸膏） ；2.5gPeptone （蛋白胨）； 0.5g Yeast extract 酵（ 母提取物 ）；2.5g Sucrose （蔗糖）； 2gMgSO4.7H2O;将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其 溶解

5、混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。2、灭菌：将盛有 500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名 称，用高压灭菌锅进行灭菌。3、 抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到 50-60C时（手可触摸） 加入已经过滤好的抗生素（100卩g/mlkan+50卩g/ml St叶50卩g/ml rif），以免温度过高 导致抗生素失效。4、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。5、分装好后，封口备用。第三组配制 MS 液体培养基1、配制 500mlMS 液体培养基：先在 500ml 三角瓶

6、中加入 400ml 蒸馏水， 称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入 5ml 100倍Fe盐浓缩 液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至 500ml，用 NaOH 调 pH=5.8。2、灭菌：将盛有 500ml 培养基的三角瓶封口， 在三角瓶表面写清培养基名称， 用高压灭菌锅进行灭菌。3、 乙酰丁香酮的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60C时（手可触 摸）加入已经过滤好的乙酰丁香酮。4、分装：将培养基分别分装到三角瓶中，每个三角瓶中倒入40ml，共12个三角瓶。5、分装好后，封口备用。第四组配制 MS 共培养基1、配制500mlMS固体共

7、培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水， 称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入 5ml 100倍Fe盐浓缩 液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照实际需要，根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调 pH=5.8，然后再加入7%的琼脂粉3.5g。2、灭菌：将盛有 500ml 培养基的三角瓶封口， 在三角瓶表面写清培养基名称， 用高压灭菌锅进行灭菌。3、分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml，共20个平皿。4、分装好后，封口备用。第五组配制 MS 分化筛选培养基1、配制1000mlM

8、S固体共培养基：用2个500ml三角瓶进行盛取，先在500ml 三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合 液，然后加入激素 NAA 和 6-BA （按照实际需要，根据母液浓度计算用量） ，混 匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8，然后再加入7%的琼脂粉3.5g。2、灭菌：将盛有 500ml 培养基的三角瓶封口， 在三角瓶表面写清培养基名称， 用高压灭菌锅进行灭菌3、分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml,共40个平皿4、分装好后，封口备用。第六组配制

9、MS生根培养基1、配制500mlMS固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入 5ml 100倍Fe盐浓缩 液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8,然后再加入7%的琼脂粉3.5g。2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称， 用高压灭菌锅进行灭菌。3、分装：将培养基分别分装到100ml三角瓶中，每个三角瓶中倒入 35ml， 共14个三角瓶。4、分装好后，封口备用。实验二植物转化工

10、程菌的制备一、仪器和试剂1仪器：低温离心机（德国 EPPENDORF公司）；恒温培养箱（哈东联）；超净 工作台（苏州净化），恒温摇床。2 试剂：根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌种 EHA105，YEB 培养基，接种环，牙签。二、实验方法1、将农杆菌接种于附加50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素、50mg/L利福 平的YEB固体培养基上，28C暗培养48h，至长出单菌落。2、用接菌环挑取单菌落，接种在含相应抗生素的 YEB液体培养基中，于 28 °C，180rp m，培养过夜。3、待菌液长至OD600为0.4 0.6时，将其按1 : 10的比例接种

11、到新鲜的上 述培养基中振荡培养，进行二次活化。实验三农杆菌侵染转化一、仪器和试剂1仪器：超净工作台(苏州净化)，植物组织培养箱 2试剂：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌种EHA105，红花无菌苗，MS液体培养基，共培养基(MS+6-BA+NAA)，手术刀，镊子，剪刀，滤 纸，培养皿。二、实验方法1、当农杆菌0D600为0.5 0.6时，吸取菌液于无菌50ml离心管中，2000rpm，离心10min,弃上清，收集菌体，用等体积的 MS液体培养基将菌体重悬， 备用。2、侵染 取红花无菌苗，在超净工作台中将子叶上下边缘切掉，置于无菌培养皿内，加入适量重悬好的菌液，侵

12、染 825 min (第一组侵染8min，第二组 侵染10min，第三组侵染12min，第四组侵染15min，第五组侵染20min，第六 组侵染25min)，此间要不时的摇动。3、 除菌侵染完成后，弃去菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液。4、 共培养 侵染过的红花子叶接种于共培养培养基上，28C暗培养3d，观 察是否有农杆菌过量生长。实验四农杆菌侵染转化一、仪器和试剂1仪器：超净工作台(苏州净化)，植物组织培养箱。2试剂：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌种EHA105，红花无菌苗，无菌水，分化培 养基 (MS+6-BA )，滤纸，镊子，培养皿。二、实验方法1、除菌 取共培养后染菌的植物材料，放于无菌三角瓶内，先用无菌水（可 以添加抗生素）冲洗至溶液澄清为止。（如果没有农杆菌滋生的，