Westernblotting实用教案

1、定义定义(dngy)： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸(xio sun)纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Towbin, H., et al. (1979). Electrophoretic tr

2、ansfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.第1页/共37页第一页，共38页。 第2页/共37页第二页，共38页。 为什么要作蛋白质印迹实验？ 研究一些(yxi)体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 了解蛋白质的分子大小，分子越迁，或分子量的改变。 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。第3页/共

3、37页第三页，共38页。Western Blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移(zhuny)至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。第4页/共37页第四页，共38页。Western Blotting 方法(fngf)一: 直接法 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号(xnho)二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便第5页/共37页第五页，共38页。Western Blotting 方法(fngf)二: 间接法 优点： 1. 免疫(miny)特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高

4、（多个二抗结合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择 缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化第6页/共37页第六页，共38页。间接Western Blotting操作(cozu)流程: 第7页/共37页第七页，共38页。 蛋白样品(yngpn)的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物(d w)显色第8页/共37页第八页，共38页。电泳(din yn)蛋白(dnbi)样品的制备上样样品的定量电泳凝胶成分注意事项第9页/共37页第九页，共38页。?通过(tnggu)有机溶剂或水溶法制备总蛋白?水溶液提取法? 针对水、稀盐、稀酸或碱溶

5、液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。? 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL AprotininLeupeptin ， ?有机溶剂提取法? 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、? 丙酮和丁醇等。?通过(tnggu)层析纯化的目的蛋白第10页/共37页第十页，共38页。蛋白样品的定量蛋白样品的定量(dngling)估计蛋白质丰度估计蛋白质丰度 Bradford法 考马斯亮蓝G-250

6、在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可与蛋白结合(jih)后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量)第11页/共37页第十一页，共38页。M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液（pH6.8, pH8.8 ）MTEMEDM过硫酸铵(时间(shjin)MTris-甘氨酸电泳缓冲液SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶-电泳电泳(din (din ynyn) )凝胶成份凝胶成份第12页/共37页第十二页，共38页。电泳(din yn)要点 上样电泳： 贪多嚼不烂 不要过多重复使用电泳Buffer 最佳分辨区分离胶的

7、2/3 电泳结果(ji gu)检查： 同样的样品跑2块胶 丽春红S SYPRO Tangerine 第13页/共37页第十三页，共38页。转膜 膜的选择(xunz) 转膜方法 转膜后确认 特殊处理第14页/共37页第十四页，共38页。第15页/共37页第十五页，共38页。转膜方法(fngf)半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转润滤纸之间，电转101030min30min。湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间将凝胶和固相基质夹在滤纸中间(zhngjin)(zhngjin)，浸泡在转移装，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转置的

8、缓冲液中，电转45min45min或过夜。或过夜。 第16页/共37页第十六页，共38页。电转仪第17页/共37页第十七页，共38页。第18页/共37页第十八页，共38页。特殊(tsh)处理第19页/共37页第十九页，共38页。封闭(fngb)1.时间2.温度3.去污剂第20页/共37页第二十页，共38页。漂洗(pio x) TBS TBST PBS PBST 漂洗(pio x)液第21页/共37页第二十一页，共38页。抗体(kngt)孵育 一抗和二抗的选择： 一抗：特异性，灵敏度（单抗，多抗，片断） 二抗：HRP活性，耦联效率，浓度 HRP，AP，未标记，生物素，荧光素，罗丹明标记 稀释(x

9、sh)倍数优化（点杂交）第22页/共37页第二十二页，共38页。一抗、二抗孵育(f y) 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时或4 过夜。 倒掉一抗溶液，用TBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢(hunmn)摇动， 37一小时或4 过夜。 倒掉二抗溶液，用TBS漂洗液滤膜3次，每次10min。第23页/共37页第二十三页，共38页。 化学发光显色(xin s)法(HRP) 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP）第24页/共37页第二十四页，共38页。 分子量标准 内参(ni cn) 膜

10、 转膜和封闭 抗体 显色第25页/共37页第二十五页，共38页。不可小看(xiokn)“蛋白标准”-分子量标准的选择 预混分子量标准(biozhn) 高分子量标准(biozhn) 低分子量标准(biozhn) 宽分子量标准(biozhn) 预染分子量标准(biozhn) 单色预染 多色预染 修饰分子量标准(biozhn)第26页/共37页第二十六页，共38页。预混分子量标准(biozhn) 高分子量标准(biozhn) 低分子量标准(biozhn) 宽分子量标准(biozhn)第27页/共37页第二十七页，共38页。预染分子量标准(biozhn) 单色预染 多色预染第28页/共37页第二十八页

11、，共38页。修饰(xish)分子量标准 糖基化 磷酸化 荧光(ynggung)标记第29页/共37页第二十九页，共38页。不可不加-内参(ni cn)的选择 原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差 种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 用法： 二抗孵育时加入HRP标记(bioj)内参抗体 分子量相差不大 分子量大小相差比较明显 第30页/共37页第三十页，共38页。原料(yunlio)是基础-膜 选择种类 NC PVDF 尼龙膜 选择标准 a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响

12、后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c. 后继(huj)实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜第31页/共37页第三十一页，共38页。膜的特点(tdin) 第32页/共37页第三十二页，共38页。抗体(kngt)的选择 作为western来讲，理论(lln)上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所

13、以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。第33页/共37页第三十三页，共38页。八仙过海，各“显”神通-显色(xin s)方法 化学显色法 : 方便、便宜(biny)、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 : 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测 同位素法 : 灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短 荧光底物法： Krypton 荧光底物第34页/共37页第三十四页，共38页。两种常用(chn yn)检测酶系统的比较第35页/共37页第三十五页，共38页。掌握(zhngw) Western blotting的原理和主要(zhyo)步骤。第36页/共37页第三十六页，共38页。感谢您的观看(gunkn)！第37页/共37页第三十七页，共38页。NoImage内容(nirng)总结定义：。