DNA的体外重组与转移

1、外源外源DNA载体载体DNA重组分子重组分子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞扩增或表达扩增或表达表达表达连接连接转化或转导转化或转导电穿孔或显微注射电穿孔或显微注射受体细胞受体细胞第一节第一节 重组重组DNA分子的构建分子的构建一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的连接酶把相互靠近的5端磷酸端磷酸与与3-OH连到一起。连到一起。优点：优点：实验操作简单，易于回收外源实验操作简单，易于回收外源DNA片段片段缺点：缺点： （1）不易定向克隆）不易定向克隆 （2） 难插入特定的基因难插入特定的基因 （3）大片段）大片段DNA的重组率低的重组率低 （4）载体易发生自身串联）载体

2、易发生自身串联 （5）目的片段自身各拷贝之间可能自连）目的片段自身各拷贝之间可能自连ligasenick碱性磷碱性磷酸酶的酸酶的脱磷酸脱磷酸作用阻作用阻止线性止线性的质粒的质粒DNA分分子再环子再环化化回收回收同尾酶的连接同尾酶的连接二、平头末端的连接二、平头末端的连接1、直接连接、直接连接55553333-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-53-OH-PP-HO-53同聚加尾法同聚加尾法 2、人工加尾形成、人工加尾形成 “粘性末端粘性末端”原理：原理：加尾加尾碱基互补碱基互补缺点：缺点：优点：优点：非酶切位点非酶切位点（1）衔接物（）衔接物（linker）连接）连接 linkerGGAA

3、TTCCCCTTAAGG linker的作用的作用3、人工接头法、人工接头法 缺点：缺点：优点：优点：（2）DNA接头接头 (adapter)连接法连接法5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 adapter adapter的作用的作用优点：优点：缺点：缺点：防止自我连接防止自我连接三、三、PCR产物的连接产物的连接1、在引物的、在引物的5端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的多克隆位点；（1）设计原则）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构3端端1520bp与模板互补；与模板互补；5端端610bp是某个内切酶的识别序列。是某个内切酶的识别序

4、列。避免与所扩增的避免与所扩增的DNA片段内部酶切位点重复。片段内部酶切位点重复。引物引物1GCAGAATTC互补序列互补序列模板模板EcoRI位点位点5-3GCAGAATTC互补序列互补序列5-33模板模板GCAGAATTC 互补序列互补序列 PCR产物产物5-33复性复性延伸延伸模板模板模板模板33CCTAGGCGG互补序列互补序列模板模板BamH I 位点位点-53-5复性复性延伸延伸模板模板模板模板33CCTAGGCGG互补序列互补序列-53-模板模板5CCTAGGCGGPCR产物产物 互补序列互补序列53引物引物2带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTCPCR产物产物

5、5-3CCTAGGCGGPCR产物产物-53- CGTCTTAAGGGATCCGCCEcoRI位点位点BamHI位点位点AATTCPCR产物产物5-3CCTAGPCR产物产物-53- GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！2、与、与T载体直接连接载体直接连接（1）PCR产物两个产物两个3端一般都有一个端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在聚合酶的特性：在DNA双链的双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。）。（2）T载体的两个载体的两个3端人为地各加一个端人为地各加一个T 利用末端脱氧核苷酸转移酶，当原料中利用末端脱

6、氧核苷酸转移酶，当原料中只有只有dTTP时，被迫在平端载体上添加时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA四、四、DNA体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项1、插入片段与载体的酶切位点互补、插入片段与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。尽量避免平端连接。2、DNA插入的方向正确插入的方向正确用双酶切用双酶切 由于产生的粘性末端不同，只能以由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3、插入基因

7、的开放阅读框（、插入基因的开放阅读框（ORF）正确）正确（1）DNA定向插入定向插入（2）起始密码子）起始密码子 尤其当尤其当载体上有载体上有ATG起始密码的时候，更要起始密码的时候，更要注意。注意。ATG CGA ATTC载体载体GGAGAATTC ATG CAG插入片段插入片段EcoRIEcoRIATG CGA ATT CAT GCA G重组重组但移码突变！但移码突变！4、防止载体自身环化连接、防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量）提高插入片段的用量连接反应体系中，插入片段比载体多连接反应体系中，插入片段比载体多10倍以上。倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体

8、载体切口的载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片段以单链连接。可以与插入片段以单链连接。53载体载体插入片段插入片段（3）用同聚物加尾法处理载体）用同聚物加尾法处理载体2. 载体自身环化连接（能存活）载体自身环化连接（能存活）3. 载体之间互相连接（能存活）载体之间互相连接（能存活）4. 插入片段互相连接（不能存活）插入片段互相连接（不能存活）5. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源五、载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果6. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）几个载体与一个插入片段

9、重组（能存活）1. 一个载体与一个插入片段重组（能存活）一个载体与一个插入片段重组（能存活）第二节第二节 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞一、重组体导入原核细胞一、重组体导入原核细胞（一）感受态大肠杆菌的制备（一）感受态大肠杆菌的制备处于能吸收外源处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。分子的生理状态的细胞。2、目的、目的增加受体菌细胞膜的通透性。增加受体菌细胞膜的通透性。1、概念、概念使用丧失了限制体系的大肠杆菌。使用丧失了限制体系的大肠杆菌。3、菌种、菌种（以（以E.coli为例）为例） 在在0 的的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca2+使

10、细胞膜磷脂层形成液晶结构，增加细胞膜的使细胞膜磷脂层形成液晶结构，增加细胞膜的通透性。通透性。 转化时加入转化时加入DNA后，后， Ca2+ 能与加入的能与加入的DNA分子分子结合，形成抗结合，形成抗DNA酶的羟基磷酸钙复合物，黏附酶的羟基磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；在胞膜的外表面；42 热激处理，细胞膜的液晶结热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，即可使外源构发生扰动，出现间隙，即可使外源DNA进入细胞进入细胞内。内。4、制备原理、制备原理5、制备过程、制备过程培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至0.3-0.4冰上冰上 5-10 min4离心收离心收集菌集菌用冰冷的用冰冷的（

11、50-100） mMCaCl2重悬重悬4离心收离心收集菌集菌4离心收离心收集菌集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的（用冰冷的（50-100）mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬（二）重组（二）重组DNA导入原核细胞的方法导入原核细胞的方法1、转化（、转化（transformation)（1）化学转化）化学转化（2）电转化）电转化 DNA分子通过与细胞膜结合进入受体分子通过与细胞膜结合进入受体细胞并在细胞内稳定维持和表达的过程细胞并在细胞内稳定维持和表达的过程10ng重组重组DNA100 L感受感受态菌态菌冰上静置冰上静置30分钟分钟42

12、C 4590秒秒加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇45分分1.5小时小时10-100 L转化液涂含转化液涂含抗菌素的平板抗菌素的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）化学转化（热休克法）化学转化（热休克法）冰上静置冰上静置23分钟分钟简单，但转化效率不高（简单，但转化效率不高（106-108/ gDNA）。）。基本原理：基本原理： 在一定强度脉冲电场的作用下，细菌细胞壁和在一定强度脉冲电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生暂时性缝隙或微孔，质粒或细胞膜产生暂时性缝隙或微孔，质粒或DNA重组分重组分子便可由此微孔进入细胞实现外源基因的转移。子便可由此微孔进入细胞实现外源基因的转移。特点：特点

13、： 转化效率高（高于转化效率高（高于109/ gDNA）。）。（2）电转化法）电转化法利用扫描电镜拍摄的电穿孔照片利用扫描电镜拍摄的电穿孔照片电穿孔仪电穿孔仪LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，4离心集菌离心集菌冰冷的水重冰冷的水重悬菌体悬菌体4离心集离心集菌菌冰冷的水重冰冷的水重悬菌体悬菌体4离心收离心收集菌体集菌体少量冰冷的少量冰冷的水重悬水重悬分装成分装成50-300 L电转仪电转仪0.5 g质粒质粒DNAOn ice混合混合加入加入1mLSOC培培养液养液37 中速震中速震荡荡60分钟分钟10-100 L转化液涂含转化液涂含抗菌素的平板抗菌素的

14、平板转化转化操作方法操作方法定义定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微每微克载体克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。 例如，例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为对大肠杆菌的转化率为108，即每微克，即每微克pUC18中有中有108个分子能进入受体细胞。如果一微克个分子能进入受体细胞。如果一微克pUC18共有共有31011个分子，也就是说，每个分子，也就是说，每3000个个pUC18分子才有分子才有一个分子进入受体细胞（一个分子进入受体细胞（108/31011）。）。（3）转化率）转化率

15、转化率的用途转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实重组实验规模。验规模。 例如，某一例如，某一DNA重组实验的重组率为重组实验的重组率为20%，转化率为，转化率为107/g载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体个重组克隆，需投入多少载体DNA进行进行重组实验？重组实验？ 若重组率为若重组率为100%，则转化后产生，则转化后产生104个重组克隆需要：个重组克隆需要： 104 /（107 100） = 0.1 g 载体载体DNA 考

16、虑到实验系统的重组率为考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体，所以实际投入载体应为：应为： 0.1 / 20% = 0.5g 载体载体DNA 载体投入量确定后，外源载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按的投入量即可按10 1的要求算出（的要求算出（5g）。）。 重组质粒重组质粒 影响转化率的因素影响转化率的因素载体本身的性质：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。其转化率不同。载体的空间构象：载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，经酶切连接操作后的载体

17、由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的空载体超螺旋质粒低两其转化率一般要比新制备的空载体超螺旋质粒低两个数量级。个数量级。插入片段的大小：插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。转化效率越低。a、生长状态、生长状态制备感受态时菌体制备感受态时菌体OD值要控制在值要控制在0.30.4。b、必须在冰冷的条件下制备。、必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。d、储存感受态细胞要在、储存感受态细胞要在-70以下以下c、CaCl2处理处理e、使用感受态菌时必须在冰上融化、使用感受态菌时必须在冰上

18、融化融化后一般不能再次冻存使用。融化后一般不能再次冻存使用。 感受态细胞感受态细胞 （competent cells） 把重组的噬菌体把重组的噬菌体 DNA或或Cosmid质粒质粒DNA包装成具包装成具有感染能力的有感染能力的 噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。体外包装（体外包装（in vitro packaging） 感受态细胞的培养感受态细胞的培养 液体培养基中培养至液体培养基中培养至OD600 = 0.5左右左右 重组重组DNA通过噬菌体蛋白或病毒蛋白包装通过噬菌体蛋白或病毒蛋白包装成有感染能力的噬菌体或病毒颗粒而进入宿主成有感染能力的噬菌体或病毒颗粒而进入宿主细胞的方式。细胞的方式。2、转导（、

19、转导（transduction) 加入新鲜培养基，加入新鲜培养基，30培养培养2小时，直至培养小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选选吸附吸附 加入经体外包装好的重组噬菌体悬液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬液，30保温保温10分钟分钟转导裂解转导裂解（1）扩增操作：）扩增操作： 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的诱导转化后的37培养培养45min

20、1.5h，噬菌体转染后，噬菌体转染后的的30培养等，均属扩增操作。培养等，均属扩增操作。（2）扩增操作的目的）扩增操作的目的u增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序程序u扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选u表达外源基因，便于筛选和鉴定表达外源基因，便于筛选和鉴定3、转化细胞的扩增、转化细胞的扩增 主要是以动植物病毒、反转录病毒及植物农主要是以动植物病毒、反转录病毒及植物农杆菌杆菌Ti质粒直接转染或转化受体细胞，把外源质粒直接转染或转化受体细胞，把外源DNA引入。引入。优点：定向性好、效率高、重复性好优点：定向性好、效率高、重复性好缺点：载体的侵染范围有限缺点：载体的侵染范围有限二、外源基因导入真核细胞二、外源基因导入真核细胞1