DNA抽提和质粒DNA制备

1、DNADNA抽取和质粒抽取和质粒DNADNA制备制备刘湘帆刘湘帆提取DNA总的原则1 1 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子分子的污染应降低到最低程度；的污染应降低到最低程度；3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也应尽量去除。也应尽量去除。核酸分子抽提的技术设计核酸分子抽提的技术设计核酸的释放：核酸的释放： 破裂细胞破裂细胞 释放核酸释放核酸

2、机械法与非机械法（非机械法中机械法与非机械法（非机械法中溶胞法溶胞法是应用是应用最广泛的方法）最广泛的方法）核酸的分离与纯化：核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇

3、等）使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤鉴定与保存鉴定与保存（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定浓度鉴定1紫外分光光度法：测定紫外分光光度法：测定DNA在在A260nm的光的光吸收值。吸收值。 如计算DNA浓度A260稀释倍数50 g/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。的核酸溶液。2 荧光光度法荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。正比。

4、适用于低浓度核酸溶液的定量分析。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。纯度鉴定纯度鉴定1 1 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 在在260260nmnm和和280280nmnm处测定处测定DANDAN溶液的光吸收，溶液的光吸收，A A260260与与A A280280之比应在之比应在1.801.80。低于此值表明。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有明有RNARNA的残留量。的残留量。A260/A280A260/A280比值是纯度检测的重要指标。比值是纯度检测的重要指标。 2 荧光光度法 核酸电泳结果进行评定。完整性鉴定凝胶电泳法：凝胶电泳法：基因组基

5、因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是电泳，观测各条带的含量，提示是否存在否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，降解；如加样槽中存在条带，可能是可能是DNA污染。污染。 核酸的贮存核酸的贮存DNA保存保存 1 短期贮存：短期贮存： 4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 2长期贮存长期贮存： TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。核酸的贮存核酸的贮存RNA保存保存 RNA可溶于可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶

6、液或双的醋酸钠溶液或双蒸水，在蒸水，在-70保存。保存。 RNA可溶于可溶于70%的乙醇溶液或去离子的的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在甲酰胺溶液中，可在-20 保存。保存。基因组基因组DNA的分离与纯化的分离与纯化DNA样品准备 常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等细胞等 生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存应贮存7070或液氮或液氮DNA提取提取1 1 酚抽提法：酚抽提法： 先用先用EDTAEDTA、 SDS SDS 、蛋白酶蛋白酶K K破碎细胞，破碎细胞，消化蛋白，然后用消化蛋白，然后

7、用pH8pH8的的TrisTris饱和饱和酚或酚酚或酚- -氯仿抽提氯仿抽提DNADNA，最后乙醇或异丙醇进行最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获沉淀。获DNADNA大小为大小为100100150150kbkb。主要试剂的作用：主要试剂的作用： EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2 降低细胞膜的稳定性SDS的作用：的作用：1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；2 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来；3 对RNA、DNA酶有抑制作用；4 与蛋白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物，使蛋白质变性。蛋白酶蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中酶和细胞中

8、的蛋白质。的蛋白质。蛋白酶蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时存在时仍保持较高活性，可同时使用。仍保持较高活性，可同时使用。 酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶酶活性。活性。 PH8.0的的Tris溶液可以似的抽提出的溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。进入水相，减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性于分相，保持分相

9、的稳定性。 2 2 甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与聚蛋白质与DNADNA的结合，再透析获得的结合，再透析获得DNADNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNADNA的复的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的子量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。 3 3 玻璃棒缠绕法：玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于

10、乙醇用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或上，然后用带钩或U U型玻璃棒在界面轻搅，型玻璃棒在界面轻搅，DANDAN沉淀液绕于玻棒。生成沉淀液绕于玻棒。生成DNADNA约约8080kbkb。 4 4 异丙醇沉淀法：基本同异丙醇沉淀法：基本同1 1法，仅用二倍法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNARNA（在异丙醇中可溶状态）。在异丙醇中可溶状态）。 5 5 表面活性剂快速制备法：用表面活性剂快速制备法：用Triton X-100Triton X-100或或NP40NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K K

11、或或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。 DNA样品的纯化：透析、层析、电泳及样品的纯化：透析、层析、电泳及选择性沉淀。选择性沉淀。 电泳法简单、快速，是电泳法简单、快速，是DNA样品纯化最样品纯化最重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳。电泳。PAGE分辨率高，适用于分辨率高，适用于5-500bp大小的片段。大小的片段。 琼脂糖含量琼脂糖含量（W/V） 线性线性DNA分离范围（分离范围（Kb） 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 3 2.

12、0 0.1 2DNA的浓缩 1、 固体聚乙二醇（固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透浓缩：用透析袋外敷析袋外敷PEG至合适量。至合适量。 2、 丁醇抽提浓缩：丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因不会。因此重复几次可显著减少此重复几次可显著减少DNA体积。体积。 DNA的检测溴乙锭染色溴乙锭染色 ：在在254254nmnm紫外光下检测，如需回紫外光下检测，如需回收最好在收最好在300300nmnm紫外光下割胶，否则易使嘌呤紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在断链，在1 1cmcm宽带上可检到宽带上可检到1010ng DNAng DNA。

13、 银染法银染法 ：AgAg+ +与与DNADNA形成复合物，在甲醛还原下形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高可染成黑褐色，灵敏度高200200倍，但不能回收。倍，但不能回收。DNA分析 通常与已知分子量的标准通常与已知分子量的标准DNADNA片段一起电片段一起电泳，经比较可获知泳，经比较可获知DNADNA标本大小，如条带标本大小，如条带拖尾，系加入拖尾，系加入DNADNA量太多或凝胶未制好，量太多或凝胶未制好，如分子量小或一片糊状，表示如分子量小或一片糊状，表示DNADNA有降解。有降解。DNA回收回收 主要是从电泳中分离回收主要是从电泳中分离回收DNA片段。片段。回收原则：尽量提高

14、回收率回收原则：尽量提高回收率 去除回收去除回收DNA样品中的污染物样品中的污染物电泳到电泳到DEAE-纤维素膜纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的附带有负电荷的DNA分子。分子。 在所需条带前插入在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳纤维素膜，继续电泳至条带至条带DNA都到膜上，取出洗下。都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的的DNA片段回收率较好，纯度高。片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过但不适用于分子量超过10kb和单链和单链DNA。 透析袋电洗脱透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲切下

15、条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提出胶后进行抽提DNA回回收。收。 低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到切下胶，加热到65熔化胶，然后抽提熔化胶，然后抽提回收回收DNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。和琼脂水解酶等。 玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将中将DNA洗脱下。洗脱下。琼脂水解酶：将含琼脂水解酶：将

16、含DNA的凝胶进行消化，的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用后使用酚抽提方法回收酚抽提方法回收DNA 问题问题从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖，目的是（ ） A 抑制核酸酶 B 保护DNA，防止断裂 C 加速蛋白质变性 D 有利于细胞破碎用SDS-酚抽提DNA时，SDS浓度十分重要，当SDS浓度为0.1%时，（ ）A 只能将DNA抽提到水相B 只能将RNA抽提到水相C 可将DNA、RNA一起抽提到水相D DNA和RNA都不能进入水相异戊醇的作用是（异戊醇的作用是（ ）A 使蛋白质脱水B 使DNA进入水相C 帮助DNA进入水相D 减少气泡，促进分相变色的

17、酚中含有氧化物，这种酚不能用于变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNA分离，原因主要是（分离，原因主要是（ ）A 氧化物可使DNA磷酸二酯键断裂B 氧化物会改变PH值C 氧化物同DNA形成复合物D氧化物在DNA分离后不易除去酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是会停留在水相和酚相之间？总是会停留在水相和酚相之间？ 酚使蛋白质分子间脱水而变性，变性的酚使蛋白质分子间脱水而变性，变性的蛋白的密度比水大，但比酚小，故停留蛋白的密度比水大，但比酚小，故停留在两者之间。在两者之间。为什么苯酚要重蒸饱和后才能用为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于于DNA的分离？的分离？

18、苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造分离，会使磷酸二酯键断裂，造成成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。另外饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低溶液，降低DNA的损失率。的损失率。质粒质粒DNA制备制备 质粒简介质粒简介质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状的小环状DNA分子分子 其大

19、小范围从其大小范围从lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. . 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。制和遗传的辅助性遗传单位。 由质粒产生的表型包括对抗生素由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、降解复杂有机化合物，以的抗性、降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等等。酶与修饰酶等等。 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具表达

20、的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术本的实验技术 质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。质粒含有编码来进行复制和转录。质粒含有编码某些酶的基因，在一定的环境下对某些酶的基因，在一定的环境下对细菌宿主有利。细菌宿主有利。质粒特性质粒特性1. 1. 分子相对小分子相对小 2. 2. 含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分 3.3.不相容性不相容性4. 4. 转移性转移性5. 5. 选择的标记选择的标记6. 6.

21、限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口常用质粒载体常用质粒载体pBR322 pBR322pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长为是一种使用最广泛的质粒，全长为43634363bpbp，由由3 3种野生型质粒成分组成，种野生型质粒成分组成，ampampr r基因来自基因来自pRSF2124pRSF2124，tettetr r来自来自pSCl01pSCl01，复制起始点来自复制起始点来自pM9pM9。核苷酸的序次核苷酸的序次号，以号，以EcoRIEcoRI序列序列GAATTCGAATTC的第一个的第一个T T为第一个核苷酸。为第一个核苷酸。 pUC系统系统l 如如pUCl8和和pUCI9，由由

22、pBR322的的ampr基因和复制子，以及大肠杆菌部分基因和复制子，以及大肠杆菌部分1acZ基因和一个多种限制性内切酶单一位点基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长的接头构成，全长2 666bp，pUCl8和和pUCl9所含多位点接头的方向正好相反。所含多位点接头的方向正好相反。 表达载体表达载体载体含有载体含有tac启动子、启动子、Lac操纵基因、操纵基因、SD序序列、列、Lac I阻遏蛋白基因等阻遏蛋白基因等 四、质粒四、质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 l 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩

23、增，随着细菌的生长，生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体白质的合成和染色体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复制不受影响而大量扩增的复制不受影响而大量扩增。l 所以使用氯霉素的主要目的，是在不减所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数

24、量体积和细菌的数量 有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。过大所致。2 2细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解 细胞生长过程中，排出大量代谢产物，细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒为了提高质粒DNADNA的纯度，离心弃上清，的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用细菌沉淀最好用STESTE或生理盐水悬浮，漂或生理盐水悬浮，漂洗洗l-2l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。去除干净。 细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸细胞的裂解方法很多，如去污剂法，

25、沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。纯化方法等多种因素综合后加以选择。 3 3质粒质粒DNADNA的抽提的抽提 质粒质粒DNA的小量制备的小量制备 2-5ml 质粒质粒DNA的大量制备的大量制备 500ml 碱裂解法碱裂解法 方法方法 煮沸法煮沸法 SDS裂解法裂解法 Triton-溶菌酶法溶菌酶法 （三）质粒（三）质粒DNADNA提取方法的选择提取方法的选择 l 常用的煮沸法，碱法常用的煮沸

26、法，碱法,SDS法均可获得法均可获得较满意效果至于有人采用碱法提取小较满意效果至于有人采用碱法提取小量细菌培养物的质粒，量细菌培养物的质粒， 用煮沸法或用煮沸法或SDS法进行质粒法进行质粒DNA的大量分离，的大量分离， 只是各个只是各个实验室的习惯问题实验室的习惯问题.l 选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑应考虑以下因素：以下因素：1菌株类型菌株类型2质粒的大小质粒的大小3细菌染色体细菌染色体DNA变性条件强弱的控制变性条件强弱的控制4细菌的培养与收集细菌的培养与收集（四）碱裂解法原理：（四）碱裂解法原理： 在在pHl2.0-12.6pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的

27、碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体大分子量细菌染色体DNADNA变性，而共变性，而共价闭环价闭环( (CC)CC)质粒质粒DNADNA仍为自然状态。仍为自然状态。 将将pHpH调至中性并有高盐浓度存在的条件调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体下，染色体DNADNA之间交联形成不溶性网状之间交联形成不溶性网状结构。大部分结构。大部分DNADNA和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂SDSSDS的作用下形成沉淀，而的作用下形成沉淀，而CCCC质粒质粒DNADNA仍然为仍然为可溶状态。可溶状态。 通过离心，可去除大部分细胞碎通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体片染色体DNADNA、RNARNA及蛋白

28、质，质及蛋白质，质粒粒DNADNA尚在上清中，再用酚、氯尚在上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒仿抽提进一步纯化质粒DNADNA。（二）煮沸裂解法（二）煮沸裂解法 利用溶菌酶和利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁，在将裂破坏细胞壁，在将裂解液煮沸。解液煮沸。 原理：加热可使蛋白质和染色体原理：加热可使蛋白质和染色体DNA变性，但变性，但环状质粒环状质粒DNA结构紧密而不会解链，温度下降结构紧密而不会解链，温度下降后，质粒后，质粒DNA又重新恢复超螺旋结构。通过离又重新恢复超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体心去除变性的蛋白质和染色体DNA，回收上清回收上清液中质粒液中质粒DN

29、A 煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如宜。如HB101及衍生菌。及衍生菌。（三）（三）SDS裂解法裂解法 比较温和的抽提方法。将细菌悬浮在等比较温和的抽提方法。将细菌悬浮在等渗的蔗糖溶液中，以溶菌酶和渗的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解裂解酚酚-氯仿抽提。氯仿抽提。 适合于大于适合于大于15kb的质粒的质粒DNA的抽提，但的抽提，但产率不高。产率不高。4 4质粒质粒DNADNA纯化纯化l 质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验的要求还应进一步纯化

30、。验的要求还应进一步纯化。CsCl溴乙锭平衡超溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。 但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒等，也可获得较好质量的质粒DNA。l 转基因动物，真核细胞转染及转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶酶切外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较高，的要求较高，一般还是

31、用超速离心法纯化质粒。一般还是用超速离心法纯化质粒。 对于对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的接用小量或中量提取的DNA样品，并不需要超样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。速离心纯化，一般可满足实验要求。1 CsCl-EB法法 超速离心将介质超速离心将介质CsCl形成一连续的密度形成一连续的密度梯度，在过量梯度，在过量EB存在下，蛋白质的密度存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；最小位于最上层；RNA密度最大沉于管密度最大沉于管底；底；DNA位于中间，由于不同结构的位于中间，由于不同结构的DNA与与EB结合度不一致，因此密度下降结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的不一致