水稻OsSsr1基因的生物信息学分析

1、水稻OsSsr1基因的生物信息学分析摘要: OsSsr1 (GeneBank登录号为NM_001065574)是NJH12表达谱中的一个表达量上调基因,为了进一步分析其序列特征、启动子序列、亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式,通过生物信息学手段对其进行分析。序列分析表明OsSsr1的开放阅读框为2004 bp,编码一个由667个氨基酸组成并含有5个跨膜区的蛋白,该蛋白N端含有一个信号肽。OsSsr1基因在氷稻不同不同组织中均有表达,在叶部的表达量最高,其次为根,在幼穗中的表达量最低;表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌等的影响。前言:水稻是中国也是全世界重要的

2、粮食作物之一，盐害是水稻生产中最不利的限制因素之一1-4。然而水稻在生长发育过程中常常受到干旱,低温和高盐等非生物胁迫，严重影响水稻的产量和品质。因此，分离鉴定水稻耐逆相关基因，培育耐逆品种，对水稻的高产稳产具有重要意义5。当植物遭受非生物胁迫时,植物会发生一系列形态、生理、化学和分子上的变化。干旱、高温和土壤盐渍化是最常见的非生物胁迫。全球农业用地大约22%是盐碱地6,并且由干旱而造成的盐碱地也在逐年增加7。植物在逆境条件下对不同环境因子响应的方式通常会重叠。尽管对麦类植物进行千旱和髙盐处理的基因表达谱显示,在不同的胁迫下响应的基因有所差异,但是它们可能诱导相似的防御反应8。一些研究结果表明

3、，来自水稻黄单胞菌的Harpin 蛋白质的编码基因hrf1 转化水稻，能够提高其对稻瘟病、水稻白叶枯病和干旱的抗性9-11。封伟等12利用农杆菌介导法将OsSsr1 基因转入烟草，提高了烟草在盐胁迫下脯氨酸的积累水平和活性氧清除能力，从而增强了其对NaCl 的耐受能力。虽然过量表达OsSsr1可显著提高转基因植株的抗逆能力，但其序列结构特征、表达模式仍不清楚。常闪闪等5人为探明OsSsr1基因的亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式，通过生物信息学手段、洋葱表皮亚细胞定位、RiceXPro 数据库和 Real-time PCR 对其进行相关的研究，得出其启动子序列包含 TGACG

4、-motif、ABRE、TCA-element 和 W box 等多个与逆境相关的顺式作用元件。GFP 融合表达显示，OsSSR1 蛋白质定位于细胞膜。RiceXPro 数据库中数据分析表明，OsSsr1 基因在水稻不同发育期的不同组织中均有表达，在叶中的表达量最高，胚中的表达量最低。Real-time PCR 结果表明，OsSsr1 表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、MeJA 和 ABA 的诱导上调。方法:查找相关文献,找到OsSsr1的登录号为: NM_001065574, 登录NCBI,输入OsSsr1(Oryza sativa L. salt-sensitive r

5、elated gene 1,)基因的登录号,搜索OsSsr1的序列。1. 用NCBI网站上的BLAST-blastn(/Blast.cgi )进行序列比对分析。 2. 用ORF Finder（/gorf/gorf.html）进行分析，并找到序列的ORF区(开放读码框架)，3. 用ExPASy网站上的ProtParam（/protparam/）进行预测蛋白质的分质量和等电点。4. 用SingalP4.0（http:/www.cbs.dtu.dk/se

6、rvices/SignalP-4.0/）对OsSsr1进行信号肽预测。5. 使用TargetP（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）对OsSsr1进行亚细胞定位分析。6. 使用 PredictProtein（/）来进行螺旋和折叠的含量分析。7. 使用NNPP（/seq_tools/promoter.html）程序预测分析OsSsr1启动子元件。8. 使用Swiss-model（/interac

7、tive）进行同源建模预测三维结构预测和分析。9. 使用MEGA4.0软件中的Neibor-joining算法构建系统发育树。10. 使用TMHMM Server v2.0（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）检测蛋白质的潜在跨膜区。11. 使用plantCARE（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线分析OsSsr1的启动子序列结果与分析1. 在NCBI上输入登录号为NM_001065574时，得到OsSsr1基因的FASTA序列为下：如图1图12. 使用BLAST-bl

8、astn进行序列比对的结果如图2图2如上图，根据颜色比例尺，hit的得分区间，与之比对结果相对较好的也就只有这4条，由于blast是区段比对，对于给定的序列，blast会把具有相识性的片段(hit)找出来，显示的是hit的信息，所以要判断两个序列的相似性，单看hit值是不够的。在Descriptions图中看出E value 都是为0，而Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:J013001G11, full insert sequence的score值相对来说是最大的，而Score值表示两序列的同源性，分值越高表明它们之间相似的程度越大，所以他们两个的相

9、似程度是最大的。3. 序列的ORF区分析，得到的结果如下。序列分析表明， OsSsr1 完整的开放阅读框为2 004 bp， 编码一个由 667 个氨基酸组成的蛋白质。4. 蛋白质的分质量和等电点分析如图3、图4.由分析结果可知：预测此蛋白质的分子量（Molecular weight）是199973.6，理论上的等电点（Theoretical pI）为4.85，氨基酸的组合大概有Ala24.8%、Cys21.6%、Gly26%、Thr27.6%。不稳定指数（）计算为42.68，所以这种蛋白质是不稳定的。脂肪指数为24.80，GRAVY的总平均为0.69。此外该蛋白质不包含任何Trp残基，这可能

10、导致在所计算的消光系数超过10的误差。考虑的序列的N末端为T（苏氨酸）估计半衰期是7.2小时（哺乳动物网状细胞，在体外），大于20小时（酵母，体内）， 大于10小时（大肠杆菌，体内）。5. 对OsSsr1进行信号肽预测分析。如下图5、图6所示，输入基因的FASTA序列，得到如下的结果. 如上图，S值表示每个氨基酸对应1个S值，在结果显示的图表中有一个曲线显示S值的变化趋势，（在full模式中可以看见具体数值），信号肽区域的S值较高。C值表示剪切位点值。每个氨基酸会有一个C值，在剪切位点处C值是最高的。Y值表示Y-max综合考虑S值和C值的一个参数，其比单独考虑C值要更精确。因为在一条

11、系列中C值可能有不止一个较高的位点，但是剪切位点只有一个；此时的剪切位点就由Y-max值来推测的，为S值是陡峭的位置和具有高C值的位点。在上图中position为23和24时，C值是最大的，Y值也达到了最高峰，所以此点为信号肽的剪切位点。表1：信号肽分析结果文本Table 1: Signal peptide analysis textMeasurePositionValueCutoffsignal peptide?max. C240.291max. Y240.502max. S80.972mean S1-230.870S1-230.7010.450YES由表1可以看出1-23有信号肽， CTA

12、-CC D=0.701 ，D-cutoff=0.450而23或者24为信号肽的剪切位点。6. 对OsSsr1进行亚细胞定位分析。如图7结果所示由图7中的sequence预测可能的值是叶绿体，即序列包含CTP，叶绿体转运肽; 线粒体，即序列包含MTP，靶向肽线粒体; 分泌途径，即该序列含有SP信号肽;7. 螺旋和折叠的含量分析。结果如图8.表2：蛋白质的二级结构组成Table 2: The composition of the protein secondary structureSec str typeHelixshEetLoop% in protein63.272.5534.18 从表二可以

13、看出蛋白质的螺旋结构占最高的含量，其次是环的含量，而折叠结构的含量最少，达到了2.55%， 上图中红色的表示Helix，螺旋结构； 蓝色表示shEet，折叠结构；绿色表示Loop，环(转角和无规则卷曲)。8. 分析OsSsr1启动子元件如图9，在框内输入FASTA序列，得到图10所示的结果。从图10中可以看出启动子预测有两种，而从2299到2349的序列的得分最高，达到0.97（最高分为1），所以它有可能是启动子序列：TATGGAAGGTTTAAAAGTCTCGAGAGCTCAACTGGAGATCACTACAAGAA而另一个的得分是0.93，相比第一个要小一些，排除其他因素的干扰，也有可能是启

14、动子元件，序列为：TGCCAGCCCCTATATATATCCCAGATTTTCTCCTTCCTTTTCTCTTGACT9. 三维结构预测和分析。根据SWISS-MODEL在线建模分析得到有三种可能的模型，分别如下图11,图12、图13.从图14中可以看出，这三个模型大部分都是一样的，只是中间的绿色部分存在较大的差异，而model #1和model # 3中的绿色部分的相似度又极高。10. 系统发育树分析；使用MEGA4.0软件中构建系统发育树。得到如下结果在利用MEGA4.0软件中的Neibor-joining算法构建系统发育树时，发现OsSsr1与0s01g0343100、0s05g0324

15、300. 0s08g0216000与另外三个功能未知的蛋白处于同一子分支上。11. 蛋白质的潜在跨膜区分析。通过TMHMM Server v2.0在线分析得到如下图15的结果。从图中我们可以看出跨膜（transmembrane）只有在0-100这个位置里面有一点，而其他地方都没有，在膜外的是最多的，由此可以看出此蛋白质的潜在跨膜区的可信度是相对较低的。12. OsSsr1基因的启动子序列分析在plantCARE中输入FATSTA序列，如图16得到如图17所示的结果；经整理得如表3所示的结果表3 OsSsr1基因启动子顺式元件预测Table3 Predicting cis-acting elem

16、ents of the OsSsr1 gene promoter调控序列名称核心序列作用Name of regulatory sequencesCore sequenceFunctionTATA-boxTAATAcore promoterAAGAA-motifGTAAAGAAAnoABREACGTGGCcis-acting element involved in the abscisic acid responsivenessACEACGTGGAcis-acting element involved in light responsivenessCAAT-boxCAATcommon cis-a

17、cting element in promoter and enhancer regionsCAT-boxGCCACTcis-acting regulatory element related to meristem expressionbox SAGCCACCnoLAMP-elementCTTTATCApart of a light responsive elementTGACG-motifTACGGTCCis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenessG-boxCACGACcis-acting regulato

18、ry element involved in light responsivenessEIRETTCGACCelicitor-responsive elementE2Fa TTTCCCGCnoSkn-1_motifGTCATcis-acting regulatory element required for endosperm expressionO2-siteGATGACATGGcis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulationGARE-motifAAACAGAgibberellin-responsive

19、element根据NCBI上公布的日本晴全基因组序列,选取CDS区上游约1200 bp的核苷酸序列作为启动子进行PlantCARE在线分析, 发现除含基本启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有多个与胁迫响应相关的顺式作用元件,包括MeJA响应元件TGACG-motif,光响应MYB结合位点MRE;脱落酸响应元件ABRE,水杨酸响应元件TCA-element,真菌诱导响应元件Box-Wl,抗病响应兀件W box和激发子、伤、病原菌响应兀件Box S。这些结果表明:OsSsr1基因可能正是通过这些顺式作用元件参与了水稻对胁迫信号传导途径的应答,在植物响应胁迫过程中发挥作用。讨论水稻

20、是中国主要的粮食作物，然而高温、低温、干旱、病害和土壤盐渍化等不良环境因素每年都会对水稻产量造成极大影响，因此，运用分子生物学技术研究其抗逆机制显得尤为重要。其上游约1 200 bp的启动子序列中含有多个与逆境相关的顺式作用元件，当外界存在刺激时，胁迫相关转录因子通过调控这些诱导元件，可以迅速激活 OsSsr1 的表达，提高其蛋白质表达量，为 OsSsr1 应答逆境信号提供了依据。SingalP 预测分析显示， OsSSR1 蛋白质 N 端有一个27个氨基酸残基的信号肽，OsSSR1- GFP融合表达结果表明其定位于细胞膜上，推测OsSSR1可能是一个分泌蛋白质。植物在逆境条件下， 体内会发生

21、一系列变化以适应胁迫环境， 如可溶性蛋白质的增加， 细胞膜组分的改变，可溶性糖与脯氨酸含量的积累以及活性氧清除能力的增强等。OsSsr1 启动子中含有逆境相关诱导元件，表明了OsSsr1 基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。参考文献：1. 汪宗立,刘晓忠,王志霞. 水稻耐盐性的生理研究: 盐逆境下水稻品种间水分和渗透调节的差异J江苏农业学报，1986，2( 3) : 1-102. 郭岩,陈少麟,张耕耘等. 应用细胞工程获得受主效基因控制的水稻耐盐突变系J. 遗传学报，1997，24( 2) : 122-1263. ZENG L H，SHANNON M CEffects of salinity

22、 on grainyield and yield components of rice at different seeding densitiesJ. Agronomy Journal，2000，92: 418 -4234. ZENG L H，SHANNON M C Salinity effects on seedling growth and yield components of riceJ. Crop Science，2000，40: 996 -10035. 常闪闪,肖姗姗,张磊,李文奇,刘凤权,邵敏. 水稻OsSsr1 基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式J.江苏农业学报，2012,28（4）：697-6986. FAO. FAO production yearbookM, 2004. FAO,Rome.7. Burke EJ, Brown SJ, Christidis N. Modeling the recent evolution of global drought and projections for the twenty-first century with the Hadley centre climate modelJ. Hydrometeor,2006,7:1113-11258. Ozturk ZN,Talame