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1、脂质体制备技术概述脂质体制备技术概述1、组成与结构理化性质及其特点、组成与结构理化性质及其特点2、口服肠溶胰岛素脂质体、口服肠溶胰岛素脂质体3、紫杉醇长循环脂质体、紫杉醇长循环脂质体4、脂质体的现状与未来、脂质体的现状与未来一、概述脂质体脂质体 （liposomes,或称类脂小球）是一种类或称类脂小球）是一种类似生物膜结构的双分子层微小囊泡。似生物膜结构的双分子层微小囊泡。 分类：分类： 1、单室脂质体：有一层类脂质双、单室脂质体：有一层类脂质双分子层构成分子层构成 2、多室脂质体：由基层脂质双分、多室脂质体：由基层脂质双分子层将被包含的水溶性药物的水膜隔开子层将被包含的水溶性药物的水膜隔开形

2、成不均匀的聚合体形成不均匀的聚合体结构与组成结构：双分子层（与胶束区别）结构：双分子层（与胶束区别）组成：磷脂及附加剂组成：磷脂及附加剂 磷脂分子形成脂质体时，磷脂分子形成脂质体时，两条疏水链指向内部，亲水基两条疏水链指向内部，亲水基在膜的内外表面上。构成的囊在膜的内外表面上。构成的囊泡将水相介质与外界隔离泡将水相介质与外界隔离。特点特点载药脂质体特点： 1、靶向性 2、缓释性 3、降低药物毒性 4、提高药物稳定性制备脂质体的材料磷脂类：卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂胆固醇：调节脂质体的膜流动性脂质体的修饰长循坏脂质体免疫脂质体糖基脂质体温度敏感脂质体PH敏感脂质体二、紫杉醇长循环脂质体二、紫杉醇长

3、循环脂质体（一）修饰以聚乙二醇（以聚乙二醇（PEG）作为修饰材料。）作为修饰材料。PEG的表面被柔顺而亲水的的表面被柔顺而亲水的PEG链链部分覆盖，极性部分覆盖，极性PEG基增强了脂质基增强了脂质体的亲水性，减少血浆蛋白与脂质体的亲水性，减少血浆蛋白与脂质体的相互作用，降低被巨噬细胞吞体的相互作用，降低被巨噬细胞吞噬的可能，延长在循环系统的滞留噬的可能，延长在循环系统的滞留时间，因而有利于肝脾以外的组织时间，因而有利于肝脾以外的组织或器官的靶向作用。或器官的靶向作用。 紫杉醇长循环脂质体到达作用部位后，发挥一系列的抗紫杉醇长循环脂质体到达作用部位后，发挥一系列的抗肿瘤作用。其作用机制主要有以下

4、三种：肿瘤作用。其作用机制主要有以下三种：1 细胞毒性作用：细胞毒性作用：紫杉醇属于有丝分裂抑制剂紫杉醇属于有丝分裂抑制剂 ,它可以诱导和促进微管蛋白聚它可以诱导和促进微管蛋白聚合合 ,抑制微管解聚。正常微管在抑制微管解聚。正常微管在 4 低温或低温或 Ca 存在下存在下可发生解聚。由于微管过于稳定可发生解聚。由于微管过于稳定 ,从而抑制纺锤体的形成从而抑制纺锤体的形成 ,使染色体不能向两极移动使染色体不能向两极移动 ,使肿瘤细胞阻滞于使肿瘤细胞阻滞于 G2/ M 期期 ,最终阻止有丝分裂的完成最终阻止有丝分裂的完成 ,因而对多种肿瘤具有较强因而对多种肿瘤具有较强的细胞毒作用的细胞毒作用 。（

5、二）作用机制（二）作用机制2 诱导细胞凋亡作用诱导细胞凋亡作用 凋亡凋亡 凋亡是正常细胞在有关基因控制凋亡是正常细胞在有关基因控制下的程序性死亡方式下的程序性死亡方式 ,肿瘤细胞正是失去了这种肿瘤细胞正是失去了这种正常控制而呈现无限制的增殖现象。紫杉醇能下正常控制而呈现无限制的增殖现象。紫杉醇能下调胞浆调胞浆 IkB - a水平水平 ,激活激活 NF - kB 并促进其并促进其转移至细胞核参与调控下游基因转移至细胞核参与调控下游基因 。研究发现。研究发现 ,紫紫杉醇可激活或调节多种与凋亡相关基因或蛋白杉醇可激活或调节多种与凋亡相关基因或蛋白 ,如如Bcl 家族、家族、P53、P21、Fas/

6、Fas配体及半胱配体及半胱天冬酶天冬酶(Caspase)家族等家族等 ,可诱导细胞出现典型的可诱导细胞出现典型的凋亡形态学改变。目前尚不清楚紫杉醇诱导细胞凋亡形态学改变。目前尚不清楚紫杉醇诱导细胞凋亡的信号传导途径以及有丝分裂阻滞和凋亡之凋亡的信号传导途径以及有丝分裂阻滞和凋亡之间的关系。但研究凋亡的重点已转移到凋亡过程间的关系。但研究凋亡的重点已转移到凋亡过程中一系列细胞内具有关键作用的蛋白质如何被特中一系列细胞内具有关键作用的蛋白质如何被特异性酶降解。凋亡发生机制中关键环节之一是异性酶降解。凋亡发生机制中关键环节之一是Caspase激活激活 ,已有研究表明在紫杉醇诱导肿瘤已有研究表明在紫杉

7、醇诱导肿瘤细胞凋亡的过程中细胞凋亡的过程中 Caspase - 3 和和 Caspase - 8 起着重要作用。起着重要作用。 紫杉醇在体外可以抑制人血管内皮细胞的增殖紫杉醇在体外可以抑制人血管内皮细胞的增殖 ,在体内可以抑在体内可以抑制鸡胚尿囊膜血管的新生制鸡胚尿囊膜血管的新生 ,其抑制作用在其抑制作用在 3.514 nmol/L 的浓度的浓度下获得并呈剂量依赖性下获得并呈剂量依赖性 ,当紫杉醇的浓度低于当紫杉醇的浓度低于 1 nmol/L 时时 ,对血管对血管和内皮细胞无明显影响。同时和内皮细胞无明显影响。同时 ,在试验所选定的浓度下在试验所选定的浓度下 ,紫杉醇在体紫杉醇在体外未能抑制肿

8、瘤细胞的增殖外未能抑制肿瘤细胞的增殖;而在而在CAM体内试验中体内试验中 ,以以CAM胚胎胚胎10g计算计算 ,即使在最高浓度即使在最高浓度14 nmol/L 下下 ,只等效于只等效于0.24g/ kg,相当相当于于 70 kg成人成人 16.8g紫杉醇的剂量紫杉醇的剂量 ,远远低于常规化疗剂量远远低于常规化疗剂量 ,提示提示紫杉醇对新生肿瘤血管的抑制机制与其细胞毒作用无关紫杉醇对新生肿瘤血管的抑制机制与其细胞毒作用无关 ,是在非细胞是在非细胞毒浓度下表现出的特点。毒浓度下表现出的特点。 (1)由于含有亲水基团（由于含有亲水基团（PEG）而能阻止血液中许）而能阻止血液中许多不同组分特别是调理素

9、与其结合，从而降低与多不同组分特别是调理素与其结合，从而降低与单核吞噬细胞系统的亲和力，可在循环系统中稳单核吞噬细胞系统的亲和力，可在循环系统中稳定存在并使半衰期延长，增加肿瘤组织对它的摄定存在并使半衰期延长，增加肿瘤组织对它的摄取。取。 (2)由于癌增长部位及感染、炎症部位病变引起毛由于癌增长部位及感染、炎症部位病变引起毛细血管的通透性增加，含有紫杉醇的长循环脂质细血管的通透性增加，含有紫杉醇的长循环脂质体能增加药物在这些部位的聚集量体能增加药物在这些部位的聚集量. (3)由于紫杉醇长循环脂质体的缓释直接作用于病由于紫杉醇长循环脂质体的缓释直接作用于病变部位，增强了治疗效果。此种增加药物的治

10、疗变部位，增强了治疗效果。此种增加药物的治疗指数的机制称为指数的机制称为“被动靶向被动靶向”。力扑素力扑素是国际首次上市的脂质体剂型的紫杉醇是国际首次上市的脂质体剂型的紫杉醇. 与其它紫杉醇产品相比，力扑素具有以下优势：与其它紫杉醇产品相比，力扑素具有以下优势： 1、避免了紫杉醇制剂因溶媒引发的超过敏反应；、避免了紫杉醇制剂因溶媒引发的超过敏反应； 2、显著降低外周循环毒性反应；、显著降低外周循环毒性反应； 3、明显提高机体对紫杉醇的耐受性；、明显提高机体对紫杉醇的耐受性； 4、显示储库效应和被动靶向效应、显示储库效应和被动靶向效应； 力扑素能明显提高患者对紫杉醇的耐受力扑素能明显提高患者对紫

11、杉醇的耐受性，小鼠静脉给药的性，小鼠静脉给药的LD50比紫杉醇注射比紫杉醇注射液大一倍液大一倍.（紫杉醇注射液为（紫杉醇注射液为33mg/kg，紫杉醇脂质体为紫杉醇脂质体为69.8mg/kg .)表明其耐表明其耐受性明显提高，为临床用药加大剂量、受性明显提高，为临床用药加大剂量、提高疗效提供了空间。提高疗效提供了空间。 动物药动学实验表明：动物药动学实验表明：（三）、制备紫杉醇长循环脂质体的（三）、制备紫杉醇长循环脂质体的材料材料紫杉醇（主药）磷脂（脂质体的基础物质）胆固醇（脂质体“流动性缓冲剂”）PEG（四）、制备方法薄膜分散法 将磷脂、胆固醇等脂质及紫杉醇溶于氯仿中，然后将氯仿溶液在烧瓶中

12、旋转蒸发，使其在内壁上形成一薄膜；将磷酸盐缓冲液加入烧瓶中不断搅拌，即得脂质体。目前，美国Endorex公司研制的口服胰岛素脂质体（Orasome），已进入临床试验阶段（二 ）脂质体通过胞吞作用进入小肠粘膜细胞小肠粘膜细胞小肠粘膜细胞小肠特点特点： 胰岛素是大分子药物，小肠无法直接吸收。而脂质胰岛素是大分子药物，小肠无法直接吸收。而脂质体是一种类似于生物膜的磷脂双分子层的载体，它可体是一种类似于生物膜的磷脂双分子层的载体，它可以和小肠粘膜细胞膜通过胞饮和胞吞作用而融合，使以和小肠粘膜细胞膜通过胞饮和胞吞作用而融合，使得包裹在脂质体内部的大分子药物胰岛素被小肠粘膜得包裹在脂质体内部的大分子药物胰

13、岛素被小肠粘膜细胞吸收，再通过胞吐作用释放到血液中，发挥降血细胞吸收，再通过胞吐作用释放到血液中，发挥降血糖的作用。糖的作用。脂质体包裹胰岛素后，能防止酶脂质体包裹胰岛素后，能防止酶 的降解作用的降解作用! 此外，脂质体通过与此外，脂质体通过与 肠道细胞膜融合或者表面吸附，肠道细胞膜融合或者表面吸附， 增加了胰岛素进入细胞的途径，增加了胰岛素进入细胞的途径， 有助于胰岛素的稳定与吸收有助于胰岛素的稳定与吸收 （三）口服肠溶胰岛素脂质体（三）口服肠溶胰岛素脂质体 材料和制备方法材料和制备方法材料材料壳聚糖壳聚糖(chitosan)(chitosan) 是甲壳素经脱乙酰作是甲壳素经脱乙酰作用后得到

14、的一种天然的带正电荷的多糖用后得到的一种天然的带正电荷的多糖, ,在自然界为仅次于纤维的最丰富的多聚在自然界为仅次于纤维的最丰富的多聚物物, ,具有亲水性、生物适应性、生物降解具有亲水性、生物适应性、生物降解性和低毒等特点性和低毒等特点, ,可以作为脂质体的稳定可以作为脂质体的稳定组分组分, ,同时还可作为吸收促进剂。同时还可作为吸收促进剂。但是但是, ,壳聚糖作为一种弱碱壳聚糖作为一种弱碱, ,需一定量的需一定量的酸才能使葡糖胺结构单元展开并转变为酸才能使葡糖胺结构单元展开并转变为带正电荷的溶液状态。在带正电荷的溶液状态。在pH pH 中性时中性时, ,壳壳聚糖分子将失去电荷并从溶液中沉淀出

15、聚糖分子将失去电荷并从溶液中沉淀出来来, ,因而壳聚糖作为吸收促进剂的潜在用因而壳聚糖作为吸收促进剂的潜在用途在大肠、结肠和直肠等碱性环境中受途在大肠、结肠和直肠等碱性环境中受到限制。到限制。N N三甲基壳聚糖盐酸盐三甲基壳聚糖盐酸盐( ( N Ntrimethyl chitosanchloride , trimethyl chitosanchloride , TMC)TMC) 具有壳聚糖相同的生物学性具有壳聚糖相同的生物学性质质, ,即使在中性即使在中性pH pH 值也能溶解和有值也能溶解和有效地降低跨上皮细胞电阻效地降低跨上皮细胞电阻, ,打开肠打开肠上皮细胞间的紧密结上皮细胞间的紧密结,

16、 ,通过细胞旁通过细胞旁路增加亲水性大分子的转运。路增加亲水性大分子的转运。海藻酸盐海藻酸盐是一种无毒、可生物降解的带是一种无毒、可生物降解的带负电荷共聚物负电荷共聚物, ,具有生物粘附性具有生物粘附性, ,能延长能延长肠道转运时间肠道转运时间, ,增加药物吸收增加药物吸收, ,同时也能同时也能有效地保护胃肠道粘膜。在低有效地保护胃肠道粘膜。在低pH pH 环境环境, ,海藻酸盐能缩聚海藻酸盐能缩聚, ,其包裹成分不释放其包裹成分不释放, ,但但包封率低。包封率低。药物经脂质体包裹后药物经脂质体包裹后, ,再用海藻酸盐包封再用海藻酸盐包封, ,可使脂质体粘合在肠道或增加制剂的转可使脂质体粘合在

17、肠道或增加制剂的转运时间运时间, ,从而有助于药物吸收从而有助于药物吸收, ,提高生物提高生物利用度。利用度。脂质体的内水相能保护胰岛素脂质体的内水相能保护胰岛素的结构和构象的结构和构象, ,而外部亲脂层有助于改善而外部亲脂层有助于改善跨生物屏障吸收。跨生物屏障吸收。脂质体药物模型脂质体药物模型制备制备壳聚糖纯化壳聚糖纯化 取食品级壳聚糖取食品级壳聚糖5 g 5 g 溶解溶解于于1 %1 %醋酸醋酸400 mL 400 mL 中中, ,过滤过滤, ,用用NHNH4 4OH OH 将滤液调至中性将滤液调至中性, ,过滤过滤, ,用水反复洗涤用水反复洗涤, ,然后冷然后冷冻干燥。冻干燥。 NH2壳

18、聚糖壳聚糖脂质体的制备脂质体的制备 用逆相蒸发法制备胰岛素脂质体混悬液。将适量磷用逆相蒸发法制备胰岛素脂质体混悬液。将适量磷脂和胆固醇溶于乙醚脂和胆固醇溶于乙醚10 mL10 mL中。称取胰岛素中。称取胰岛素4 mg 4 mg 溶于溶于0.05 0.05 molL molL - 1- 1 HCl 0.5mL , HCl 0.5mL ,再加入再加入pH 7.4 PBS 2.5 mL ,pH 7.4 PBS 2.5 mL ,然后然后与乙醚液混合与乙醚液混合, ,振摇振摇, ,浴式超声仪超声浴式超声仪超声5 min ,5 min ,所得乳剂在所得乳剂在旋转蒸发仪上减压蒸去有机溶剂旋转蒸发仪上减压蒸去有机溶剂, ,探针式超声探针式超声0.5 min ,0.5 min ,加加壳聚糖或海藻酸钠溶液在壳聚糖或海藻酸钠溶液在10 10 水浴旋转孵化水浴旋转孵化60 min60 min即得即得包覆的胰岛素脂质体混悬液。包覆的胰岛素脂质体混悬液。电镜观察脂质体包裹药物电镜观察脂质体包裹药物A: Uncoated li