VEGF基因多态性与广西地区壮族妇女复发性自然流产的相关性研究

1、vegf基因多态性与广西地区壮族妇女复发性自然流产的相关性研究摘要目的：复发性自然流产是妊娠初期最常见的并发症之一，其病因及发 病机制及极繁杂，目前临床上尚无明确有效的预测和防治措施。本研究旨 在探讨血管内皮生长因子(vegf)的基因位点- 2578c/a、-1154g/a、- 634g/c、- 460c/t和 + 936c/t 的单核甘酸多态 性(snps)与广西地区壮族妇女复发性自然流产(rsa)患者发病的关系，从 基因水平探讨rsa发病的基因易感性，寻求与rsa相关的vegf易感基 因，进一步阐明rsa发病的分子生物学机制，为研究rsa的发病机理提供 一种可行性的方法。方法：病例组选取门

2、诊就诊的复发性流产患者共120例，对照组选取 门诊就诊的健康经产妊娠妇女和住院待产的健康经产妊娠妇女共110例， 两组入选观察对象均抽取静脉血，并采用传统手工苯酚-氯仿法提取全血 dna,采用pcr-限制性片段长度多态性方法(pcr-rflp)检测两组观察对象 vegf基因5个多态位点的snps基因型的表达和频率分布情况。结果：vegf - 2578c/a、- 1154g/a、- 634g/c、- 460c/t 和 + 936c/t5个位点snps的各个基因型和等位基因频率表达分布在rsa组和 对照组间差异均不显著，没有统计学意义(p0.05)。结论：vegf - 2578c/a、- 1154

3、g/a、- 634g/c、- 460c/t 和+ 936c/t 5个位点的基因多态性可能与广丙地区壮族妇女复发性自然流产的发病易感性不相关联。研究结果与部分研究不同可能是多态性位点在不同地区，不同种族、民族，不同人群中的作用不一致所致。关键词：血管内皮细胞生长因子，复发性流产，基因多态性the association of vegf single nucleotidepolymorphisms and patients withrecurrent spontaneous abortion inguangxi zhuang women.abstractobjective： recurrent s

4、pontaneous abortion is one of the most common complications in early pregnancy.because of its complex etiology and pathogenesis，so there is no effective clinical prediction and prevention and control measuresat until now . this research was to explore vascular endothelial growth factor (vegf) - 2578

5、c/a、- 1154g/a、- 634g/c、- 460c/t and + 936c/t single nucleotide polymorphisms (snps) associated with the pathogenesis of recurrent spontaneous abortion (rs a)，from the gene level to discuss the rsa genetic susceptibility，looking for the rsa susceptibility genes, further clarify the rsa molecular biol

6、ogy mechanism of the disease, to investigate the pathogenesis of rsa provide a feasibility of the method.method： case group was 120 patients with recurrent spontaneous abortion，the control group was in the hospital for the delivery of 110 cases of normal pregnant women，the two groups was observed ob

7、ject extraction of venous blood, and adopt of the traditional manual phenol - chloroform extraction whole blood dna，application of pcr-restriction fragment length polymorphism (pcr - rflp) detection in the two groups observed vegf five loci of snps genotype frequency distribution.results： there was

8、no obvious difference aboutvegf - 2578c/a、- 1154g/a、- 634g/c、- 460c/t and + 936c/t five loci snps of genotype and allele frequency distribution between the case group and the control group，with no statistical significance (p value>0.05).conclusion：thesnpsofvegf - 2578c/a、- 1154g/a、- 634g/c、- 460c

9、/t and + 936c/t may be related to the guangxi zhuang women with recurrent spontaneous abortion were not associated with susceptibility to disease. the results may be different polymorphism loci in different regions, different racial, ethnic, caused by the role of different populations are inconsiste

10、nt.key words: recurrent spontaneous abortion(rsa)，vascular endothelial growth factor (vegf) ,genetic polymorphism复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion，rsa），旧时也称为 惯性流产，是指女性与同一性伴侣发生连续3次或3次以上的自然流产。 2009年，辅助生殖技术国际监测委员会（icmart）和世界卫生组织（wto） 确定了复发性自然流产的定义为连续2次及2次以上的自然临床妊娠的丢 失。1966年，世界卫生组织（wto）将自然流产定义为：在妊娠

11、28周之 前，胎儿重量小于1000克，尚不能独立存活，在没有采取人工方法情况下 从母体内自然剥离者，称为自然流产。1977年，世界卫生组织（who）确 定了自然流产的定义为，怀孕20周以前中止妊娠、胎儿重量低于500克以 下者。目前，自然流产的期限存在较多争议，一些国家将其期限定为小于 25周，甚至是20周之前，原因是在发达地区孕龄大于20周，胎儿体重 在600700g之问的新生儿因为得到充分的治疗也能得到存活的可能。然 而，根据0前国内的实际情况，仍将流产期限定在28周之前。这使rsa 发生率从原来的1%上升致5%1。是怀孕初期最常见的并发症之一，对rsa 患者夫妇的身心健康产生严重影响。r

12、sa的病因十分复杂，夫妇双方染色 体异常、内分泌失调、生殖道异常畸形、免疫因素、感染、宫颈机能不全、 血栓形成倾向、心理精神因素等均可导致复发性流产的发生2。但仍有50% 的患者复发性自然流产的原因不明，称为原因不明复发性自然流产 (unexplained recurrent spontaneous abortion,ursa)，其发生机制尚小明了。血管内皮细胞生长因+ (vascular endothelial growth factor，vegf)及 其家族成员属于血小板源性生长因子家族，是近年来逐渐发现的在结构和 功能上存在部分相似的一系列细胞因子。vegf家族目前包含6个成员，即: v

13、egf (又称 vegf-a) > vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e、胎盘生 长因子(pigf),均是二聚体糖蛋白5'6。vegf是一种能特异作用于血管内 皮细胞发育的生长因子，能特异性地增进内皮细胞分裂、增殖及迁移，且 能直接诱导血管生成并提高新生血管的渗透性，在新生血管生成过程当中 起着关键作用。vegf的促血管作用常见于胚胎发育、伤口愈合过程和肿瘤 新生血管的形成等过程4。vegf基因位居染色体的6p21.3上，基因全长为28kb，编码vegf的 基因全长约14kb，巾7个内含子和8个外显子交替间隔构成，vegf分子 量约为34-46kd,是由分子量为

14、17-22kd的两个和同亚基通过二硫键连接 起来发挥作用的糖蛋白，单体形式无生物活性。人vegf基因经过不同的 剪切方式形成成不同亚型的异构体，分别为vegf121、vegf 165 > vegf206、vegf 189和vegf 145。vegf121是可溶性的分泌蛋白，能分泌到细胞外，vegf165是部分可溶性分泌蛋白，也是vegf主要的分泌形式 和主要的效应分子7。vegf189和vegf206是不溶性的分泌蛋白，多结合 在细胞膜和基底膜屮。vegf的受体有三个，分别为：vegfr-1/flt-l、 vegfr-2/flk-l/kdr和vegfr-3/flt-4,三者均为跨膜酪氨酸

15、激酶受体， vegfr-1和vegfr-2受体主要分布在血管内皮细胞上，其屮vegfr-2主 要表达在胚胎血管中，其在成熟血管的表达率下降，vegfr-3可能与淋巴 管的形成相关8。近年来研究显示9, vegf基因多态性与多种疾病关系密切，包括肿 瘤生长转移、心脑血管疾病、炎症反应过程和复发性流产等。wang等在研 究乳腺癌中显示1q，vegf基因表达的蛋白在肿瘤细胞质和细胞上广泛存 在。也有研究发现h，在敲除vegf及其受体基因的老鼠模型屮，老鼠由 于胚胎血管发育严重不良或不发育导致死胎。vegf是重要的血管生成激活 剂，可诱导血管生成和血管通透性增加，其对子宫-胎盘血管系统的调节在 女性生

16、殖系统屮占非常重要的位置12。庞丽红等研究表明13，vegf及其受 体sflt-1的mrna在绒毛组织屮的表达在早期rsa患者屮比正常妊娠者 高，因此vegf及其受体sflt-1有讨能均参与了早期rsa的病理过程。也 有研究已经发现，如果降低vegf表达或不表达，可导致不良绒毛血管网络 的形成、滋养细胞分化不良和浸润及异常胎盘发育不良，最终导致流产的 发生14。越来越多的证据表明' rsa的发生与血管内皮细胞生长因子（vegf） 及其基因多态性关系密切。一些学者认为2，rsa的发生是基因在环境诱 导下的异常表达所致，存在于vegf基因上的一些多态性位点可能通过对其 基因转录活性的调节而

17、影响蛋白的表达，故vegf基因多态性的遗传易感性 可能在rsa的发病机制中起重要作用。壮族作为本国第二大民族，这方面 的研究较少，故本研究采用病例-对照的研究方法，对vegf - 2578c/a、-1154g/a、- 634g/c、- 460c/t和+ 936c/t这5个较常见多态位点从基因水平探讨广西壮族妇女rsa基因易感性，寻找其rsa的易感基因，进一 步阐明rsa发病的分子生物学机制，为复发性流产的早期诊断和防治提供 理论依拋。研究对象与实验材料一.研究对象：本研究的观察对象均为广西壮族人群。1. 病例组选取2011年12月至2013年5月在广西医科人学第一附属医院产 前诊断与遗传中心门

18、诊部就诊的复发性流产患者共120例，平均年龄 29.90±4.32。同时符合以下条件：既往与同一性伴侣有发生连续自发性流产 史02次），孕期3个月，夫妇染色体检查正常，b超检查排除女方生殖 道畸形，内分泌检查正常，并排除自身免疫性疾病和全身性疾病等，男方 精子常规排除异常。2. 对照组选取2011年12月至2013年5月在广西医科大学第一附属医院产 前诊断与遗传中心门诊部就诊的健康经产妊娠妇女和在本院产科住院部住 院待产的正常妊娠妇女共110例，平均年龄28.75±4.93。并满足以下条件： 至少与同一性伴侣有1次正常妊娠分娩史，无自然流产、死胎、死产史以 及其他不良孕产史

19、，b超检查结果未见生殖道畸形异常，并无自身免疫性疾 病、内分泌异常及全身性疾病等病史。本实验由广西医科大学第一附属医院的伦理委员会准许。经观察对象 知情同意后在无菌条件下采集其外周静脉血2-5ml，立即置于edta抗凝管 中，摇匀后暂存于-20°c冰箱。采血用途均告知患者或其家属，经其同意 并签署知情同意书后方执行，并询问病史收集整理所有实验对象相关临床 资料，如年龄、孕产次数等。所有观察对象均无亲缘关系。二.主要试剂：1. dna提取相关试剂：0.9%生理盐水；75%酒精；15mmtes溶液（自配）（由15mm tris-hc1（ph=8）、15mm edta、15mm nacl

20、等比例制成）；10%sds 溶液（自 配）（10克sds粉末溶于100ml三蒸水屮）；tris平衡酚（上海江莱技术有 限公司）；氯仿、异戊醇及无水乙醇（上海江莱技术有限公司）；三蒸水（实 验室自备）等。其中15mmtes溶液、10%sds溶液、tris平衡酚及无水 乙醇均保存于2-8°c下。1）taqdna聚合酶（上海生工生物工程技术有限公司）2）mgcl2（25mm） buffer（上海生工生物工程技术有限公司）3）loxpcr buffer （without mg2+： 100 mm tris-hcl ph 8.8 at 25°c ）（上海生工生物工程技术有限公司）4）

21、500 mm kc1 0.8%（v/v）nonidet （上海生工生物工程技术有限公 司）5）dntp （lomm）（上海生工生物工程技术有限公司）6）6xdnaloading dye （上海生工生物工程技术有限公司）7）pcr产物纯化冋收试剂盒（上海生工生物工程技术有限公司sk1141）3引物：pcr引物（上海生工生物工程技术有限公司） 4酶切相关试剂：限制性内切酶（mbi公司）5 .电泳相关试剂：琼脂糖粉（sigma公司）（bbi公司） （biohao 公司） （sigma 公司）dna marker 1xtbe缓冲液 核酸染料三.主要仪器：1. pcr反应扩增仪（加拿大bbi公司）；2.

22、sw-cj-1d洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；3. dk-8d型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；4. dyy-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；5. 高速低温离心机（德国eppenndorf centyifuge）；6. h6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；7. 凝胶成像系统（gene genius公司）；8. 微量核酸蛋白测定仪（nanodrop公司）；9. 移液器（范围 100-100（1, 20-200（li1，0.5-10|il）（加拿大 bbi 公司）10. 微波炉（national公司）；11. -20°c普通冰箱（海尔）；12.

23、 -80°c低温冰箱（德国西门子）；13. 颗粒制冰机（上海安亭科学仪器厂）14. 冰盒（上海江莱技术有限公司）实验方法一.提取全血基因组dna：采用传统的苯酚氯仿手工提取法。1. 将2ml冰冻全血从-80°c冰箱屮取出，放于室温10-15分钟，使其 解冻。2. 用2ml规格巴氏吸管吸出解冻后的全血2ml置于10ml ep管巾，加入 0.9%nacl生理盐水2-3ml,充分摇晃至30秒后置于低温离心机屮在41下以70000rp/5miri速率离心，静置后去掉上清，保留沉淀。3. 再次重复加入0.9%nacl生理盐水2-3ml,充分摇晃至30秒后置于低温离 心机中在4

24、6;c k以70000rp/5min速率离心，静置后去掉上清，保留沉淀， 并用滤纸将ep管口残留的液体吸干。4. 在沉淀中加入15mmtes溶液l-2ml，充分摇晃至沉淀冲散溶解；再加入 10%sds溶液150-200（11（约9滴），充分混匀；最后加入tris平衡酚l-1.5ml, 充分混匀后置于低温离心机中在4°c下以70000rp/5min速率离心，静置后 液体分为两层，两层中间有少量灰白色沉淀物，取上层液体移入另一 ep管 中备用。5. 加入氯仿-异戊醇（24:l）2ml （现用现备，不存留过夜），充分摇匀至起白色 泡沫后置于底温离心机中在4°c下以70000rp/

25、5min速率离心，静置后液体 分为两层，上层液体清亮，两层中间有少量白色沉淀物，将上层液体移入 另一 ep管中备用。6. 再加入是上个步骤中上层液体2.5-3倍无水乙醇，并顺时针快速旋转至棉 絮状的dna团全部吸出。7. 将巴氏吸管细管口剪断直至人管口，用其吸出dna团及少量无水乙醇， 放入1.5mlep管中，置于-80°c冰箱备用。二.洗涤、溶解dna及dna浓度的测定和纯度鉴定1. 将装有dna的ep管取出，放于低温离心机内4°c下以13000rp/5min速 率离心，使dna团聚集并沉于管底或侧壁。移至消好毒的超净台屮操作， 用移液枪将无水乙醇慢慢吸出，并用滤纸吸干；

26、加入500（11 75%酒精对dna 闭块进行吹打洗涤，尽量不要将dna块打散，吸出酒精并用滤纸吸干，重 复一次。吸干后，放于超净台屮晾干1-2小时。2. 根据dna量加入150-250）11不等的三蒸水，并用移液枪吹打致dna团 块溶解于三蒸水中。3. 将溶解于三蒸水屮的dna置于超净台内室温下24小时，使其充分溶解。4. 次日从易溶解好的dna溶液中取0.1 |il置于微量核酸蛋白测定仪中检测 其浓度及纯度，od值均在1.8左右，越接近1.8说明dna的纯度越高。根 据dna的浓度大小将其调整至工作浓度。三.vegf多态性检测1目的基片段扩增：是以提取的基因组dna为模板进行pcr扩增。从

27、genebank数据库（af437895）及相关文献屮查询到vegf基因全长。利用 primer5.0软件，根据vegf基因多态位点相对应的基冈序列来设计pcr扩 增引物，并引物由上海生工生物工程技术有限公司合成（表1）。pcr反应体系和酶切反应体系分别为（表2、表3），pcr扩增程序（表4）。表1 pcr引物及酶切条件vegf多态位点引物内切酶f.57-2578c/a(rs699947),r:5-ccttagg ac acc ataccg at - 3z-tggtttctgacctggctatt-3zbglllf:5,-1154g/a(rs 1570360),r:5-ggtcg agcttc

28、cccttc att - 3'-gacaggcgagcctcaggc-3zecol47 if:5,-634c/g(rs2010963)-aaag aggtagcaag agctcc ag ag - 37-c actc actttgcccctggc 3'haelllf.5z-460c/t(rs833061)-gtgcgtgtggggttgagcg-37-aaggcggagagccggacac3zbshl236 if.5z+ 936c/t(rs3025039)-cctg a aatg aagg aag agg agac - 37-tcggtg atttagc agc a ag aa

29、 3zhinl ii表2 pcr反应体系梭板体积loxtaq buffer2.5pldntp(2.5mm each)2.0pl上游引物(50pmol/pl)0.5pl下游引物(50pmol/pl)0.5plmgcl22.0pl三蒸水16.3gl总体积25gl表3酶切反应体系pcr产物体祝(pl)10 x buffer r2|1酶(10u/gl)11三蒸水7pl总体积20gl表4pcr扩增程序步骤温度时间stepl95 °c5分钟step295 °c30秒step368 °c45秒step472 °c60秒step595 °c30秒step658

30、 °c30秒step772 °c40秒step872 °c6分钟step94 °c保存注:少骤2-4重fi 20个循环；步骤5-7重复20个循环将酶切反应体系置于37'c恒温水箱中孵育过夜，使其充分消化。取酶 切产物1o(li1进行3%的琼脂糖凝胶电泳，置于1xtbe缓冲液屮，通电，稔 压150v,电泳吋间每个位点均为30分钟，根据电泳条带bp值判断每个个 体基因型。pcr产物和酶切反应产物如表5。vegf多态位点pcr产物长度酶切片段k：度-2578c/a(rs699947)309bpc:309bpa:205bp+104bp-1154g/a(r

31、s 1570360)144bpg:144bpa:107bp + 37bp-634c7g(rs2010963)145bpc:145bpg:107bp + 38bpt:152bp-460c/t(rs833061)152bpc:113bp+39bp+ 936c7t(rs3025039)149bpc:149bpt:95bp + 54bp统计学处理所有数据均输入计算机，采用spss16统计分析软件包分析。对全部计 量资料进行正态性检验，且正态性分布资料以均数土标准差或中位数表示， 并采用t检验进行两组年龄差屛性比对，选用x2检验分别对两组多态性位 点基因型和等位基因型频率表达分布进行数据分析并进行har

32、dy-weinberg 平衡检验两组基因频率是否具有群体代表性。以非条件logistic回归的法子 来计算代表相对风险度的比值比(odds ratio ? or)和其95%可信区间 (confidence interval，ci)。以p<0.05作为差别有统计学意义。结果一.两组年龄进行正态性检验，结果提示均符合正态性检验(如1、2)病例组12-o-0 |15.020.025.030.035.040.0年龄45.0aou<dnba>ju.图2 对照组aoudnbdju-病例组平均年龄为29.90±4.32,对照组平均年龄为 28.75士4.93，对两组年龄进行t检验

33、分析，结果10.954，？=0.331，即？0.05,病例组与对照组年龄差异没有统计学意义，可认为两组间年龄差别不人 具备可比性。二、pcr及限制性内切酶的结果(如3、 4、 5、 6、 7)500bp400bp300bp200bp150bpmb-3o9bfl-2o5bp104bploobp 鄕二snps基因分型 1、2、8: ccffi因型5、7: aa®因37bp图 3 vegf - 2578c/a m：分子s标准；3、4、6: ca琅因型 ；5oobp 400bp 3oobp 200bp-15obp- loobp 75bp 5obp 25bp 图 4 vegf-1154g/as

34、nps ®因分型m 12345678500bp 400bp 300bp 2£>0bp 150bploobp 75bp 50bp 25bp - 145bp 107 bp3sbp图5 vegf - 634gc snps基因分型m:分子量标准 1、2、4、5、6、7: gc基因型；3: cc基冈型；8:gg基因型ml 2345672q0bp 150bp loobp 75bp 50bp 25bp 152bp 113 bp39bp图 6 vegf -460c/t snps 基因分型m：分子量标准；1、2、5、6、7: ct基因型；3、4、5: tt菽因型ml 234567850

35、0bp 400bp 300bp200bp 150bp loobp 75bp 50bp 25bp i 149bp 95bp s4bp三.各组基因频率和等位基因频率分析统计学处理结果显示，病例组和对照组 vegf- 2578c/a、- 1154g/a、- 634g/c、- 460c/t 和 + 936c/t 5个多态位点基阴型频率表达分布均与hardy-weinberg平衡一致(p值0.05)。(1).病例组vegf- 2578c/a位点基因型ca、cc和aa分别为63(52.5%)、49(40.8%)和 8(6.7%)及等位基因频率c和a分别为161(67.1%)和79(32.9%)。对照组 v

36、egf- 2578c/a位点基因型ca、(3(3和分别为46(41.8%)、58(52.7%)和 6(5.5%)及等位基因频率c和a分别为162(73.6%)和58(26.4%)与病例组对 比差异均不明显，无统计学意义(p0.05)。(2).病例组vegf - 1154g/a位点基因型ga、gg和aa分别为46(38.3%)、68(56.7%)和 6(5.0%)及等位基因频率g和a分别为182(75.8%)和58(24.2%)。对照组 vegf - 1154g/a位点基因型ga、gg和aa分别为33(30.0%)、72(65.5%)和 5(4.5%)及等位基因频率g和a分别为177(80.5%

37、)和43(19.5%)与病例组对 比差异均不明显，无统计学意义(p0.05)。(3).病例组vegf - 634g/c位点基因型cg、cc和gg分别为61(50.8%)、9(7.5%)和 50(41.7%)及等位基因频率c和g分别为79(32.9%)和161(67.1%)。对照组 vegf- 634g/c位点基因型cg、cc和gg分别为70(63.6%)、10(9.1%)和 30(27.3%)及等位基因频率c和g分别为90(40.9%)和130(59.1%)与病例组 对比差异均不明显，无统计学意义(p0.05)。(4).病例组vegf- 460c/t位点基因型ct、(3(3和丁丁分别为62(5

38、1.7%)、8(6.7%)和 50(41.7%)及等位基因频率c和t分别为78(32.5%)和162(67.5%)。对照组 vegf- 460c/t位点基因型ct、(3(3和丁丁分别为46(41.8%)、5(4.5%)和 59(53.6%)及等位基因频率c和t分别为56(25.5%)和164(74.5%)与病例组对比差异均不明显，无统计学意义(p0.05)。(5)病例组vegf + 936c/t位点基因型ct、cc和tt分别为21(17.5%)、94(78.3%)和 5(4.2%)及等位基因频率c和t分别为209(87.1%)和31(12.9%)。对照组 vegf + 936c/t位点基因型c

39、t、cc和tt别为30(27.3%)、77(70.0%)和 3(2.7%)及等位基因频率c和t分别为184(83.6%)和36(16.4%)与病例组对 比差异均不明显，无统计学意义(p0.05)。如(表6)。表6 vegf5个多态位点基因型和等位基w型频率在w组患者中的比较vegf多态位点蕪因型等位基因型病例组(n=120)病例组(n=120)x2值p值例数/频率()例数/频率()c/a63(52.5%)46(41.8%)-2578c7ac/c49(40.8%)58(52.7%)3.2650.195a/a8(6.7%)6(5.5%)c161(67.1%)162(73.6%)a79(32.9%)58(26.4%)2.3570.125g/a46(38.3%)33(30.0%)-1154