基因工程的基本操作工具资料讲解

1、基因工程的基本操作工具打破种的界限，定向改造生物打破种的界限，定向改造生物基因重组基因重组实例：用大肠杆菌生产人的胰岛素实例：用大肠杆菌生产人的胰岛素操作步骤：将操作步骤：将人的胰岛素基因（人的胰岛素基因（目的目的基因基因）转移到转移到大肠杆菌（大肠杆菌（受体细胞受体细胞）中，通过微生物的发酵使大肠杆菌中，通过微生物的发酵使大肠杆菌表达人的胰岛素基因，从而表达人的胰岛素基因，从而获得人获得人的胰岛素（的胰岛素（结果结果）。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的个别基因复制出来，加以修饰种生物的个别基因复制出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，改造

2、，然后放到另一种生物的细胞里，定向改造生物的遗传性状。定向改造生物的遗传性状。基因操作的工具基因操作的工具基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：行基因操作最少需要以下三种工具：、基因的剪刀、基因的剪刀限制性内切酶（限制酶）限制性内切酶（限制酶）一种限制酶一种限制酶只能只能识别识别一种一种特定的特定的核苷核苷酸酸序列序列，并在特定的，并在特定的位点位点上将上将DNA DNA 分子切分子切断。目前已发现的限断。目前已发现的限制酶有制酶有5 500

3、00多种。多种。重播重播切割位点切割位点实质；实质；2个磷酸二酯键的断裂个磷酸二酯键的断裂 氢键会自然断裂氢键会自然断裂DNADNA被限制酶切断后有两个被限制酶切断后有两个反向互补反向互补的的“黏黏性末端性末端”（单链的片段）（单链的片段）。被同一种限制酶切断的。被同一种限制酶切断的几个几个DNADNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。行配对。磷酸二酯磷酸二酯键键切割位点切割位点看P10-11例题：-GAATTC-解答： 切载体：切载体： 切目的基因：切目的基因：-GAATTC- -GAATTC- -GAATTC- -GAATTC-GAATTC- -C

4、TTAAG- -CTTAAG-CTTAAG- -G AATTC- -G AATTC-G AATTC- -CTTAA G- -CTTAA G-CTTAA G- (1），），5-GACGTC-3(2），），-AGGCCT-(3），），- AATT- 切载体切载体 切目的基因切目的基因、基因的针线、基因的针线DNADNA连接酶连接酶连接酶的作用是：将连接酶的作用是：将互补配对的两互补配对的两个黏性末端个黏性末端连接起来，使之成为一个完整连接起来，使之成为一个完整的的DNADNA分子。分子。重重播播、基因的针线、基因的针线DNADNA连接酶连接酶连接酶的作用是：将连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性互

5、补配对的两个黏性末端连接或平口末端末端连接或平口末端起来，使之成为一个完整起来，使之成为一个完整的的DNADNA分子。分子。实质：（氢键容易结合）实质：（氢键容易结合）催化形成磷催化形成磷酸二酯键。酸二酯键。AATTGCCTTAAG“分子缝合针分子缝合针”DNA连接酶连接酶两者都是将两者都是将双链双链DNA片段片段“缝合缝合”起来，恢复起来，恢复被限制酶切开的两个核苷之间的磷酸二酯键。被限制酶切开的两个核苷之间的磷酸二酯键。但但Ecoli DNA连接酶只能连接酶只能“缝合缝合”黏性末端不黏性末端不能能“缝合缝合”平末端；平末端；而而T4 DNA连接酶既能连接酶既能“缝合缝合”黏性末端又能黏性末

6、端又能“缝合缝合”平末端。平末端。根据来源不同可分为根据来源不同可分为 : Ecoli DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶在性质上两者在性质上两者 异同点：异同点：3 3、基因的运输工具、基因的运输工具运载体运载体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将目的基因送入细胞的工具就是运载体。胞内去！能将目的基因送入细胞的工具就是运载体。运载体必须同时满足运载体必须同时满足三个要求：三个要求：具有多个限具有多个限制酶切点；能在宿主细制酶切点；能在宿

7、主细胞内稳定保存并复制表达；胞内稳定保存并复制表达；具有标记基因具有标记基因。 常用的载体有质粒、常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等；噬菌体、动植物病毒等；最早用的载体是一种环状最早用的载体是一种环状DNADNA质粒。质粒。目目的的基基因因插插入入位位点点4 4、下列关于限制酶的说法正确的是、下列关于限制酶的说法正确的是A A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少很少B B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C C、不同的限制酶切割、不同的限制酶切割DNADNA后都会形成黏性末端后都会形成黏性末端D

8、D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键B CDCABABC 平平 T4DNA连接酶连接酶 黏性黏性 Ecoli DNA连接酶连接酶基基因因克克隆隆操操作作目前被较广泛提取使用目前被较广泛提取使用的目的基因有：的目的基因有： 苏苏云金杆菌抗虫基因、人云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等。基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤( (一）提取目的基因一）提取目的基因将需要的基因从将需要的基因从供体供体生生物的物的细胞细胞内提取出来。内提取出来。供体生物细胞供

9、体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪去用限制酶剪去多余部分多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶提取目的基因的方法提取目的基因的方法直接分离基因直接分离基因( (从基因文库中获取）从基因文库中获取）鸟枪法鸟枪法将供体生物的将供体生物的DNADNA用限制酶切割为许多片段，再用运用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。工程就算成功了。该法最大的该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成缺点是带有很

10、大的盲目性，工作量大，成功率低功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。人工合成基因法人工合成基因法有两种方法：有两种方法： 直接合成法直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使信使RNARNA核苷酸顺序，再据此推算出基因核苷酸顺序，再据此推算出基因DNADNA的脱的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。的基因。DNADNA合成仪合成仪（3 3）利用）利用PCRPCR技术扩增目技术扩增目的基因的基因 P P1414逆转录法逆转录法：以信使：以信使RNARNA

11、为模板，在逆转录酶的作用下为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成将脱氧核苷酸合成合成DNA(DNA(基因基因) )。质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种( (二二) )目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合4.4.过程过程: :( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入动物动物细胞细胞将目的基因导入将

12、目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、

13、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交从苏云金芽苞杆菌中提取从苏云金芽苞杆菌中提取抗虫基因抗虫基因从土壤农杆菌中提取带从土壤农杆菌中提取带有选择性标记的质粒有选择性标记的质粒同一种限制同一种限制酶处理酶处理抗虫基因与质粒结合形成抗虫基因与质粒结合形成重组质粒重组质粒将重组质粒导入土壤农杆菌将重组质粒导入土壤农杆菌筛选筛选将土壤农杆菌与棉花将土壤农杆菌与棉花细胞混合培养细胞混合培养侵染侵染重组质粒将抗虫基因导重组质粒将抗虫基因导入棉花细胞并整合到棉入棉花细胞并整合到棉花的花的DNA上上植物组织培养植物组

14、织培养获得抗虫棉获得抗虫棉抗虫棉的培育流程图：抗虫棉的培育流程图：-P13积极思维积极思维1）基因工程依据的遗传学原理是（）基因工程依据的遗传学原理是（ ）A基因突变基因突变 B基因重组基因重组 C染色体变异染色体变异 DDNA复制复制B2）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能

15、在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C3）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA4）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶可用于目的基因的获取限制性内切酶可用于目的基因的获取 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的

16、基因不用限制性内切酶5）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、只要把目的基因导入受体细胞就会产、只要把目的基因导入受体细胞就会产生相应的蛋白质生相应的蛋白质6）基因工程是在）基因工程是在DNA分子水平上进行设计分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达7、基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有、基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用。基因工程基