非放射性标记物BrdU研究进展

1、非放射性标记物brdu研究进展澳脱氧尿囉唳核昔是dna前体胸腺囉喘核昔类似物，通 过竞争掺入s期细胞单链dna核昔酸序列替代胸腺囉唳。b rdu与胸腺囉噪竞争掺 入的强度可能与细胞增殖异常有关，如肝癌细胞约的胸腺 囉唳被替代，而正常肝细胞仅有1。既往在分子遗传学等 研究中常采用同位素标记，但有放射污染，技术难度大，实 验周期长等缺点。近年来非放射性标记物的研究发展迅速, 然而其敏感性多数不及同位素，使实验应用受限。自82年g ratzer制备出抗brdu单抗及标记检测技术不断改良提高， 应用brdu标记的敏感性已与氛胸腺喘唳核昔相似2, 3。 目前认为brdu是最有希望取代同位素的非放射性标记

2、物之 -o本文综述近年来brdu研究概况，重点介绍标记过程中 有关技术问题。一、标记技术：1、剂量和途径：brdu可用于体内或体外标记，体内标记时，实验鼠按体 重60mg -200mg/kg于鼠腹膜下注射4, 5,狗按体重 100mg/kg静脉注射6,人体以表面积150 n g/m2用量，取标 本前静脉注射7,免疫组化检测。brdu经静脉给药一般无 副作用，偶有报道过量可致细胞突变。体外标记的研究广泛 而深入，通常将保存在培养液中的新鲜组织剪11 卒至1-2mm3大 小，离心去除了上清液后，加入looug/mlbrdu,或新鲜组 织在/ml浓度的brdu中37摄氏度1小时，然后固定包埋8, 细

3、胞标记在rpm 11640-10培养液中进行，细胞数低于1x10 6/ml,加入20卩1的brdu孵育209。2、标本处理：适当的标本处理对brdu染色强度至关重要omeyer对450 例乳腺癌组织体外标记总结出3点经验:切组织块vlmm厚； 固定前组织有代谢活力；封闭脱氧胸腺核昔合成酶2,因 此酶能使脱氧尿昔转变成脱氧胸昔，从而阻止内源性脱氧胸 昔与brdu竞争掺入dna。xiang最近回顾大量文献。广泛讨 论固定包埋方法后，制备狗胫骨骨折模型，设3组对照研究， 结果证明70%乙醇固定，ep on包埋未脱钙狗骨组织的erdu 染色效果最好6 o swales和smi th用brdu单抗在超微

4、水 平研究昆虫血脑屏障，重点探讨标记过程对细胞超微结构特 征的影响。作者比较4种固定后得出如下结论：单用多聚甲 醛固定可获得良好的标记效果，但细胞结构易损伤，可加入 单节显性戊二醛联合固定；等渗缓冲液加蔗糖磷酸/盐酸缓 血酸胺缓冲剂或pbs对保持细胞结构有较好效果；用脱氧胆 酸处理可增加标记，促进抗体联接，该项研究清晰显示线粒 体，高尔基体、内质网等结果器10。也有人建议如准备蛋 白酶消化时，可用甲醛固定，而不用ca rnoy或乙醇。3、dna变,性brdu掺入单链dna碱基序列须经酸、碱、酶或加热等打 开dna双螺旋结构中的氢键，离子键和碱基推积力使dna双链 分离单链。dna变性方式及程度

5、直接影响标记效果， williamson等回顾123份关于结直肠癌的报告，发现用酸变 性约占80%,作者在间设9个浓度比较分析，对每种浓度作用 的组织切片分别数5x1 03个细胞，结果冰冻切片vhcl浓 度变性后标记指数最高。低浓度酸产生高l i的原因可能dna 双链失稳态，组胺蛋白离解产生易使抗原掺入的sssna片段, 另有人提出用低浓度酸从dna离解出组胺蛋白后加热变性, 可避免组胺产生稳定dna低抗热变性的作用。消除组胺可降 低原位dna的熔解温度阈，酸预处理使染色质核小体结构几 乎全部破坏，从而使dna解螺旋更广泛11。坚持热变性者 认为加热较酸对brdu掺入能提供更多结合部位。此外，

6、变 性和单抗孵育须严格衔接，如变性后bu20a单抗孵育延误1 小时，brdu阳性细胞核标记数便从%降至%7,说明影响li 的因素复杂，加单抗前仔细研究变性技术及干扰因素，从而 获得br du标记应有的高li是必要的。另外采作brdu标记 核酸分子可能对dna变性有特殊要求，需进一步探索。4、标记染色：如何延长brdu作用时间以标记新进入s期的细胞。使增 殖缓慢的细胞标记率提高，是另一个重要问题，早年有人用 恒定套管装置和非生物降解弹丸对大鼠研究，但结果重复性 差。近来may singer研制一种具有很好的生物相容性可降解 的微囊用于体内、外标记，通过电镜、影像技术及免疫细胞 化学分析，证明微囊

7、中brdu能有效掺入鼠脑疾患周围的增 生细胞核中，可连续释放高浓度brdu达4 8-50小时12。 另有人研究渗透性微囊和缓弹丸，发现标记效果均优于单次 注射。研究非放射性标记物常与放射性标记物相比，以证明特 异性，敏感性及其它有关特性，在同一靶细胞比较似乎更具 有说服力。然而3h-tdr和brdu的比标记研究不能在同一时 间给药，因两种标记物在同一个细胞增殖周期内竞争胸腺喀 噪激酶。有人认为两种标记先后给药均可，另有主张先标 brdu,理由是3h-tdr放射自显影乳胶用胰酶去除时偶有细胞 丢失，致其后brdu标记信号损失，lin等强调br du标记时 间较3h-td r长约50分钟，如先标记

8、3h-tdr可望brdu能标 记更多早期s期细胞3 o thoolen从另外角度观察两种标记 染色之间关系，将成年的雄鼠分3组，腹膜下分别注射3h-tdr, brdu和两中标记物曲小时后取睾丸标记处理，免疫金银法染 色，分别计数精原细胞每组平均阳性胞核数量，结果3h-td r标记为162个，brdu标记为166个，双标记为146个说明 90%br du掺入的清原细胞显示3 htdr标记，另有10%胞核仅 显示一种标记，无交叉性。3h-tdr的b射线散射范围有限， 使放射自显影反应不可能超过远离乳胶lum以上的胞核， 这些胞核或许能被brdu标记显色，少数细胞仅接受一种标 记的确切原因不清楚，也

9、可能与碱基配对所形成的氢键数量 有关。此外已证明微波，氯化锂13、氟尿囉除核昔等均有 助于brdu标记。二、检测：br du特异掺入s期细胞，通常测定其li,即s期细胞占 细胞周期的百分数，标记阳性为光镜下致密覆盖于胞核上的 褐色沉淀物。检测方法用单抗或多抗的免疫化学法，也可用 dna荧光染料染色的细胞化学法。目前常用免疫金银法，因 该法不受内源性过氧化酶影响，较免疫酶标法有更好对照背 景。不同类型细胞dna对变性敏感性的差别可能由染色质结 构决定，某些类型对变性反应迟钝，使检测不敏感或失败, 有人提倡单抗联接b rdu后用fcm检测较免疫组化法更客观 省时，且可测出肿瘤倍体14。但需注意恶性

10、瘤常伴组织及 细胞坏死，:brdu不能掺入死亡细胞，故用fcm分析须除外死 亡细胞，否则可被错误当成静止细胞。胰酶和dnase混合孵 育细胞标本有可能克服死亡细胞干扰三、brdu标记和3h-tdr标记的比较与32p、35s等常用放射性核素相比，3h-tdr释放的b -粒子能量低，散射极少，因此感光乳胶上的成影分辨最高， 放射性损伤相对较小，且半衰期较长。3h -tdr标记用放射 自显影术和闪烁计数检测，灵敏度高，结果确切。其应用价 值已经肯定。因此研究非放射性标记物多以3h-tdr为标准 对照。在肿瘤生物学和细胞增殖动力学的研究中，mayer在 试管内分析一组人乳腺癌大样本，比较brdu和3h

11、-tdr的标 记效果，3h-tdr标记234例，平均li为士； btciu标记450 例，平均土,两种标记物无显著差异(p>)obrd u和3h-tdr 标记的肿瘤大小，组织类型，淋巴结转移，胞核大小以及dna 倍体均正相关，充分说明两种标记物之间的密切关系。在同 一靶细胞标记也证明9 0%以上标记3h-tdr阳性细胞也标记 有brdu,反之亦然。四、应用：brdu标记用于dna修复、复制、分子杂交的重组dna技 术可替代同位素标记，在分子生物学、遗传学、细胞增殖动 力学，肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力等领域有广泛 应用价值。kitazaws等用brdu标记对白血病细胞hl-60和

12、k562基因表达进行研究，将标记dn a和rna原位杂交，发 现80%用于合成dna的胸腺囉噪被brdu替代1 50stevenson 等用brdu单抗和fcm对哺乳动物细胞balb/c, 3t3, colon2 6等6种细胞系研究杀瘤性巨噬细胞的细胞毒作用对细胞动 力学的影响。受试细胞系接触之前，先经br du脉冲标 记，即在适当时间加入brdu,只作用短时间马上洗去，以保 证brdu掺入dna的精确时间，结果发现在12小时的细胞培 养中，6促细胞系的细胞均可被杀瘤性m©阻滞在细胞周期的每一个时相内16 o近几年来，由于brdu标记方法敏感、简单和迅速，该技 术在肿瘤增殖动力学领域

13、的研究也非常活跃17-20 o目前 brdu标记不仅用于肿瘤诊断，评估预后，对指导肿瘤治疗已 受重视，将活检标本li作为术后的是否行辅助治疗的依据， 尤其对增大的区域淋巴结价值更大，区域淋巴结已转移病例 可按li高低确定化疗方案，现已明确小剂量化疗后肿瘤复 发者是li高的病例，而不是li低者。值得提出的是b rdu 的li较fcm的di更客观可靠，因fcm难于识别双相二倍体 和异倍体肿瘤dna分布的s期细胞，而且di的s期细胞数 也可能含有死亡细胞21。此外已证明brdu替代腺11 密喘所 合成的dna对放射性物质更敏感，使肿瘤对放疗的敏感性增 加22, 23 o可以预言，brd u标记作为一

14、种新近倍受重视 的材料和方法在生物医学领域的应用前景将会十分广阔。参考文献knol ja. walkersc, roberisonjm, etof5-bromo- 2deoxyuridin eintocolorec tallivermeta stasesandliv erinpatients receivinga7-dayhepaticar terialinfusi on. cancerres ,1995,55：368 7meyerjsk oehmsl,hughe sjmetlabdlin gfors-phasem easurementinbreastcarcio nma cancer, 19

15、93,71： 3531entandoftrit atedthymidin eandbromodeo xyuridineinc orporationby thesamecels. jhistochemcy tocheml993,4 1:1435thoo lenb brdurdl abelingofs-p hasecellinte stesandsmall intestineofm ice,usingmic rowaveirradi ationforimmu nogoldsilver staninganimm uncoytochemi calstudy, jhi stochemcytoc heml

16、990, 38： 2 67pollacka . terrynha,wu cseta1. speci ficstaingofi ododeoxyurid ineandbromod eoxyuridinei ntumorsdonbl elabelledinv ivo；acellana lysiscytomet ry 1995,20：5 3xiangzma rkelmd.bromo deoxyuridine immunohistoe hemistryofep onembededund ecalcifiedbo neinacaninef ractureheali nghistochemc ytoche

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20、kolbaht, preparationc haracterizat ion andrelea seofmicroenc apsulatedbuo modeoxyuridi nelifescienl 994,54:27s axea gibsong .effectoflithiumonincorporationofbro modeoxyrridi neandtritate dthymidinein tohumanparat hyroidsurg, 1 993,128： 865ritterma. newapproachesto cellkineticsinhumantumor s. current

21、pro bcancer, 1993 ,17： 343kit azawastakena kaaabenetal . insitudnar nahybridizat ionusinginvi vobromodeoxy uridinelabeleddnaprobe h istochemistr y,: 195stev ensonap. cris smanha,stewa rtccmactopha geinducedcyt ostasiskinet icanalysisof bromodeoxyur idinepulsedc ells icytomet ryl985,6： 578nylanderka nnerothg,gustafssonhetki neticsofhead andnecksquamouscellcarcinomasactaoncologica, 1994 ,33:23ritt erma. albrect sonjt. kimyt. eta1. tumourc ell