植物组织培养技术二实用教案

1、会计学1植物植物(zhw)组织培养技术二组织培养技术二第一页，共91页。 营养(yngyng)条件培养基(culture medium)A 概念(ginin)第1页/共91页第二页，共91页。第2页/共91页第三页，共91页。 目前(mqin)国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：第3页/共91页第四页，共91页。第4页/共91页第五页，共91页。1 水第5页/共91页第六页，共91页。大量(dling)元素：指浓度大于0.5mmolL的元素。其作用是：第6页/共91页第七页，共91页。第7页/共91页第八页，共91页。微量元素(yun s)： 指小于0.5mmolL的元素(yu

2、n s)，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。第8页/共91页第九页，共91页。第9页/共91页第十页，共91页。1）碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持(zhch)许多组织很好的生长。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%，但在胚培养时采用4%-15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要(zhngyo)作用。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。第10页/共91页第十一页，共91页。2）维生素(vitamin)这类化合物在植物细胞里主要是以

3、各种辅酶的形式参与(cny)多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸(yn sun)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0110mgL。第11页/共91页第十二页，共91页。3）肌醇 (myoinosltol)在糖类的相互转化中起重要作用(zuyng)。用于构建细胞壁、细胞膜。使用(shyng)浓度一般为lOOmgL。第12页/共91页第十三页，共91页。4）氨基酸(almino acide)是很好的有机(yuj)氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用(chn yn)的氨基酸是甘氨酸。用量在1

4、0-1000mgL之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别(tbi)需要，以不用为宜。第13页/共91页第十四页，共91页。第14页/共91页第十五页，共91页。第15页/共91页第十六页，共91页。第16页/共91页第十七页，共91页。在组织培养中，生长素主要被用于诱导(yudo)愈伤组织形成，诱导(yudo)根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度(nngd)下，(10-510-8rngL)就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内(t ni)也易受到体内(t ni)酶的分解。组织培养中常

5、用人工合成的生长素类物质。第17页/共91页第十八页，共91页。第18页/共91页第十九页，共91页。2）细胞分裂素类 ( cytokinin )这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激动(jdng)素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6BA。第19页/共91页第二十页，共91页。GA ( gibberellic acid赤霉素)第20页/共91页第二十一页，共91页。生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长 根还是长芽。如为了促进芽器官的分化(fnhu)，应除去或降低生长素的 浓度，或者调整培

6、养基中生长素与细胞分裂素的比例。在组织培养中一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL， 细胞分裂素0.0510mgL。生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。第21页/共91页第二十二页，共91页。Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on th

7、e lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the con

8、trol mediumtissue culture in the African Violet 第22页/共91页第二十三页，共91页。No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferen

9、tiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant第23页/共91页第二十四页，共91页。NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface,

10、and few shoots. Some callusNo MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.第24页/共91页第二十五页，共91页。第25页/共91页第二十六页，共

11、91页。琼脂(agar) 在固体(gt)培养时琼脂是最好的固化剂。第26页/共91页第二十七页，共91页。加入琼脂的固体(gt)培养基与液体培养基相比优缺点：优点(yudin)：在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，缺点： 因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。第27页/共91页第二十八页，共91页。抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失(snsh)，尤其是快速繁殖中对于(duy)刚感染的组织材料，可向培养基中

12、注入5%10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。注意：第28页/共91页第二十九页，共91页。第29页/共91页第三十页，共91页。第30页/共91页第三十一页，共91页。第31页/共91页第三十二页，共91页。一、母液(stock solution)的配制(pizh)和保存1 什么是母液？第32页/共91页第三十三页，共91页。2 母液配制(pizh)的注意事项：第33页/共91页第三十四页，共91页。二、 母液的配制(pizh)方法将培养基配方中的各种( zhn)成分分别配成一定浓度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。2 注意事项：1单

13、配法：第34页/共91页第三十五页，共91页。水药品(yopn)糖琼脂(qingzh)水玻璃器皿及其他准备+加热融化混匀混合调节PH值定容分装灭菌冷却接种第35页/共91页第三十六页，共91页。第36页/共91页第三十七页，共91页。第37页/共91页第三十八页，共91页。移液器四、 常用(chn yn)设备移液管第38页/共91页第三十九页，共91页。第39页/共91页第四十页，共91页。第40页/共91页第四十一页，共91页。酸度计简称pH计，由电极(dinj)和电计两部分组成。第41页/共91页第四十二页，共91页。第42页/共91页第四十三页，共91页。第43页/共91页第四十四页，共

14、91页。第44页/共91页第四十五页，共91页。2种激素5种浓度(nngd)的实验组合6-BAmg/L） 0 0.5 2.5 5 10NAA 0 1 2 3 4 5(mg/L) 0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 对培养基中两个或两个以上(yshng)因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.

15、5，5，10mgL)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验见表33。 二、多因子试验(shyn)第45页/共91页第四十六页，共91页。第46页/共91页第四十七页，共91页。第47页/共91页第四十八页，共91页。第48页/共91页第四十九页，共91页。第49页/共91页第五十页，共91页。组培中光照(gungzho)是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照(gungzho)时间方面： 1）光照强度(light intensity)第50页/共91页第五十一页，共91页。第51页/共91页第五十二页，共91页。第52页/共91页第五十三页，共91页。湿度的影

16、响包括培养容器(rngq)保持和环境的湿度条件第53页/共91页第五十四页，共91页。第54页/共91页第五十五页，共91页。第55页/共91页第五十六页，共91页。种类种类最适最适pH值值种类种类最适最适pH值值杜鹃杜鹃4.0月季月季5.8越桔越桔4.5胡萝卜、石刁胡萝卜、石刁柏柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7不同(b tn)植物的最适pH值 第56页/共91页第五十七页，共91页。第57页/共91页第五十八页，共91页。第58页/共91页第五十九页，共91页。培养(piyng)第59页/共91页第六十页，共91页。第60页/共91页第六十一页，共91页。简单(jindn)，一

17、般只要有培养室及接种箱即可。优点(yudin)：定义：指在培养液中加入一定的凝固剂，使培养液固化，然后将外植体直接介入此培养液中的培养适用范围：一般用于组织块、愈伤组织、短枝或茎尖等材料的培养第61页/共91页第六十二页，共91页。第62页/共91页第六十三页，共91页。定义(dngy)：适用范围：一般用于细胞、原生质体的培养，也可用于愈伤组织、胚状体等材料的继代培养。常见类型：液体静置培养液体振荡培养第63页/共91页第六十四页，共91页。定义(dngy)：优点：培养液中不会出现营养物质浓度差异的现象，用来进行营养方面的研究。具体做法：试管中先放入培养液，然后放入滤纸，滤纸制成桥状的支持物，

18、使它正巧贴在液面上，最后把组织放在滤纸上。滤纸像灯芯一样不断给组织提供水分和养料。第64页/共91页第六十五页，共91页。定义(dngy)：优点：既可保证营养液的充分混合，又保证了组织块呼吸所需的气体交换。第65页/共91页第六十六页，共91页。1.初代培养(piyng)第66页/共91页第六十七页，共91页。第67页/共91页第六十八页，共91页。第68页/共91页第六十九页，共91页。一、试管(shgun)苗的特点：第69页/共91页第七十页，共91页。驯化(xnhu)的目的：提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用(gungh-zuyng)的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管

19、苗的移栽成活率。驯化的原则：应从温度、湿度、光照、及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步 适应的目的。驯化的方法：首先进行练苗，即将长有完整试管苗的培养瓶由培养室转移到半遮荫的自然光下进行锻炼23d ，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合能力和健壮度，然后打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐减低温度，转向有菌。驯化一般进行1-2周。第70页/共91页第七十一页，共91页。 试管(shgun)苗的移栽第71页/共91页第七十二页，共91页。第72页/共91页第七十三页，共91页。当长出2-3片新叶时，就可将其移栽(y zi)

20、到田间或盆钵中。第73页/共91页第七十四页，共91页。第74页/共91页第七十五页，共91页。第75页/共91页第七十六页，共91页。第76页/共91页第七十七页，共91页。外植体的消毒(xio d)外植体的选择2 初代培养物的建立无菌环境的获得规范的接种操作提供适宜的外植体培养条件第77页/共91页第七十八页，共91页。外植体形态发生(fshng)的途径外植体愈伤组织体细胞胚器官分化小植株小植株脱分化再分化4 培养产物的观察记载见教材63页5 试管苗移栽驯化第78页/共91页第七十九页，共91页。第79页/共91页第八十页，共91页。一、初代培养(piyng)外植体材料的褐化问题1 外植体材料褐化原理：第80页/共91页第八十一页，共91页。第81页/共91页第八十二页，共91页。第82页/共91页第八十三页，共91页。第83页/共91页第八十四页，共91页。第84页/共91页第八十五页，共91页