抗衰益智胶囊对拟衰老大鼠脑内单胺类神经递质和胆碱能神经递质含量影响的研究

1、抗衰益智胶囊对拟衰老大鼠脑内单胺类神经递质和胆碱能神经递质含量影响的研究摘要：目的 观察抗衰益智胶囊对衰老模型大鼠脑组织胆碱乙酰转移酶/乙酰胆碱酯酶（ChAT /AchE）活性、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）含量的影响。方法 受试动物按随机数字表法分为空白对照组（n=10）和模型组（n=62）。采用D-半乳糖（0.125 g·kg-1）皮下注射建立衰老模型并筛选符合衰老模型的大鼠，按随机数字表法分为模型组、抗衰益智胶囊中药大剂量组（18g·kg-1）、小剂量组（4.5g·kg-1）和脑复康组（7g·kg-1），经药物干预后分

2、别测定各组大鼠脑组织内ChAT /AchE、NE、DA和5-HT含量。结果 与空白组比较，模型组大鼠脑组织内AchE活性升高，ChAT活性降低（P<0.05）；NE、DA、5-HT含量降低（P<0.05），应用抗衰益智胶囊治疗后，治疗组大鼠脑组织内AchE活性降低（P<0.05），ChAT活性升高（P<0.01），NE、DA、5-HT含量增高（P<0.05）。结论 抗衰益智胶囊具调节衰老模型动物脑组织单胺类和胆碱能神经递质代谢而发挥脑功能保护的作用。关键词：胆碱能神经递质；单胺类神经递质；衰老模型；大鼠；抗衰益智胶囊Abstract: Objective To e

3、xplore effects of KangShuaiYiZhi Capsule (KSYZ) on ChAT/AchE and monoamine neurotransmitter, NE, DA and 5-HT levels in the brain tissue of aging model rats. Methods 72 rats were randomly divided into 2 groups: a normal group (N=10) and a model group (N=62).The subacutely aging model rats were made b

4、y injecting D-gal (0.125 g·kg-1) into abdominal cavity continually, then aging rats were numbered and grouped by random number table into the model group, KSYZ high-dose group (18 g·kg-1·d-1), KSYZ low-dose group (4.5 g·kg-1·d-1) and NaoFuKang group (7 g·kg-1·d-1).

5、 After treated for 60 days and then activity of ChAT and AchE, cerebral cortex NE, DA, and 5-HT levels were evaluated. Results Activity of AchE were much higher (P<0.05), but level of ChAT, NE, DA and 5-HT in model group were significantly downregulated when compared with normal group (P<0.05)

6、. After treated with KSYZ, activity of AchE were downregulated, ChAT, NE, DA and 5-HT levels were significantly upregulated (P<0.01, P<0.05). Conclusions The results demonstrated that KangShuaiYiZhi Capsule upregulated sincaline and monoamine neurotransmitter levels in the brain tissue of agin

7、g model rats, and played a very important role in improving cerebral function.Key words: Cholinergic neurotransmitter; Monoamine Neurotransmitter; Aging model; Rats; KangShuaiYiZhi Capsule目录：1 实验材料1.1 动物1.2 药品与试剂1.3 主要仪器2 实验方法2.1 动物分组 2.2 造模与给药 2.3 组织取材与标本制备2.4 统计学处理3 结 果3.1 各组大鼠脑组织ChAT/AchE活性的比较3.2

8、 各组大鼠脑组织5-HT、DA和NE含量的比较4 讨 论参考文献研究表明1由衰老诱发的老年痴呆存在脑组织单胺类和胆碱能神经递质代谢紊乱和认知障碍。祖国医学则将衰老性痴呆归属于“呆病”的范畴，强调衰老性老年痴呆是脾肾两虚、痰瘀互阻、本虚标实为特征的老年病2-3，目前中医药防治老年痴呆的临床和实验研究方兴未艾，在某些研究方面显示出中医药防治此病的优势。故本实验采用名老中医经验方“抗衰益智胶囊”干预治疗拟衰老大鼠，以期从其脑组织中单胺类和胆碱类神经递质代谢变化，探讨抗衰益智胶囊对衰老大鼠脑功能的保护作用。1 实验材料1.1 动物SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，3月龄，体重180-220g，由甘肃

9、中医学院医学实验中心提供。（SPF级动物合格证号：SCXK（甘）2011SPF级实验设施合格证：SYXK（甘）2011。1.2 药品与试剂 抗衰益智胶囊由熟地、枸杞、黄芪、肉苁蓉、三七、南星、麝香、三七等中药组成，上述药材均购自兰州医药公司药材市场，先将熟地、枸杞、黄芪、肉苁蓉等按特定比列配伍后用砂锅煎煮，文火慢煎，头煎40min，次煎50min，两煎滤液去渣，将药液混合，然后将滤液浓缩至清膏状；将特定比列麝香、三七等药打粉过120目筛，并将粉末药与浓缩中药混合，干燥，按比例分装成胶囊；脑复康（西安交大瑞鑫药业有限公司，批号101217）

10、；D-半乳糖（Dgalactose）（上海试剂二厂产品，批号110516）；乙酰胆碱脂酶测试盒（Acetylcholine esterase，AchE，批号20121105）；乙酰胆碱转移酶测试盒（Choline acetyltransferase，ChAT，批号20121109）；去甲肾上腺素测试盒（Noradrenaline，NE，批号RT120371）；多巴胺测试盒（Dopamine，DA，批号RT121123）；5-羟色胺测试盒（5-Hydroxytryptamine，5-HT，批号RT121122）。1.3 主要仪器酶联免疫检测仪（规格型号：BENCHMARK PULS，美国BIO-

11、RAD）；电热恒温培养箱（规格型号：L-303，金坛市恒丰仪器厂生产）。2 实验方法2.1 动物分组 受试动物适应性饲养1周后，将72 只大鼠按体重编号，以随机数字表法抽取10只为空白对照组，其余62 只为造模组并按文献4造模。所有动物在统一条件下（室温18，相对湿度30% 左右）普通饲料喂养，自由饮水。2.2 造模与给药 采用每天腹腔注射D-半乳糖（0.125 g·kg-1/大鼠），连续注射6 周，造成大鼠拟衰老动物模型，模型建立成功后用跳台法筛选符合衰老标准大鼠，再将模型动物按照随机数字表法分为模型对照组、脑复康对照组、抗衰益智胶囊中药低剂量组、抗衰益智胶囊中药高剂量组，每组10

12、只。从第50d 开始各组大鼠灌胃给药治疗。测定动物体重，计算给药量，以后每10d 测体重1 次，以便调整药量。等效剂量以成人常规剂量按人与动物体型系数折算5：即中药高剂量组（18g·kg-1，相当于60 kg重成人每日临床用量的10倍）、中药低剂量组（4.5 g·kg-1，相当于60 kg重成人每日临床用量的2 倍）分别按2ml/次灌胃；脑复康对照组( 7 g·kg-1，相当60kg重成人每日临床用量的5 倍)，2ml/次灌胃；模型对照组每日给予2ml 生理盐水，各组每日灌胃1 次，连续60d。2.3 组织取材与标本制备各组动物于末次灌胃给药治疗后，禁食不禁水12

13、 h，测体重作记录后，3% 戊巴比妥钠（30mg·kg-1）将大鼠麻醉，断头处死，脑组织匀浆制备：采血后断头处死，低温条件下快速取脑组织，以冰冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后置于匀浆器中用9倍生理盐水匀浆（匀浆器的末端置于放冰块的冷水中），后以3500转/分离心10分钟，取上清液置4冰箱保存，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定效应指标。2.4 统计学处理采用SPSS13.0软件统计，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD分析，方差不齐时用Dunnetts方法分析。3 结 果3.1 各组大鼠记忆能力及记忆潜伏时间的比

14、较见表1 表1 各组大鼠记忆能力及记忆潜伏时间的比较（n10，±s）组 别剂量（g·kg-1）记忆能力（正确次数）记忆潜伏时间 （s） 空白对照组模型对照组中药大剂量组中药小剂量组脑复康对照组-18.04.507.0053.33±12.5270.07±11.8257.71±9.31366.25±13.5663.17±14.32184.20±12.57159.13±15.51180.57±12.81169.50±20.00177.23±15.98注：与空白对照组相比较P <

15、;0.05；与模型组比较P < 0.05，P < 0.01结果见表1。实验结果表明：与空白对照组比较，模型组大鼠脑组织AchE计数水平显著升高，ChAT计数水平显著降低，对比组之间的差异具有统计学意义（P0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠脑组织AchE计数水平显著降低，ChAT计数水平显著升高，且以抗衰益智胶囊大剂量组作用为优，对比组之间的差异具有统计学意义（P0.05）。3.1 各组大鼠脑组织ChAT/AchE活性的比较见表1 表1 各组大鼠脑组织ChAT/AchE活性的比较（n10，±s）组 别剂量（g·kg-1）AchE（U·mg prot-

16、1）ChAT（U·mg prot-1）空白对照组模型对照组中药大剂量组中药小剂量组脑复康对照组-18.04.507.0053.33±12.5270.07±11.8257.71±9.31366.25±13.5663.17±14.32184.20±12.57159.13±15.51180.57±12.81169.50±20.00177.23±15.98注：与空白对照组相比较P <0.05；与模型组比较P < 0.05，P < 0.01结果见表1。实验结果表明：与空白对照组

17、比较，模型组大鼠脑组织AchE计数水平显著升高，ChAT计数水平显著降低，对比组之间的差异具有统计学意义（P0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠脑组织AchE计数水平显著降低，ChAT计数水平显著升高，且以抗衰益智胶囊大剂量组作用为优，对比组之间的差异具有统计学意义（P0.05）。3.2 各组大鼠脑组织5-HT、DA和NE含量的比较见表2表2各组大鼠脑组织5-HT、DA和NE含量的比较（n10，±s）组 别剂量（g·kg-1）5-HT（µg·g-1）DA（µg·g-1）NE（µg·g-1）空白对照组模型对照组中药

18、大剂量组中药小剂量组脑复康对照组-18.04.507.000.65±0.080.48±0.120.60±0.120.53±0.140.61±0.110.78±0.090.59±0.100.70±0.140.61±0.080.71±0.150.55±0.120.37±0.090.51±0.100.40±0.120.52±0.11注：与空白对照组相比较P <0.05，P <0.05 ；与模型组比较P < 0.05，P < 0.

19、01结果见表2。实验结果表明：与空白对照组比较，模型组大鼠脑组织5-HT、DA和NE计数水平显著降低，对比组之间的差异具有统计学意义（P<0.01，P0.05，P0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠脑组织5-HT、DA和NE计数水平显著升高，且以抗衰益智胶囊大剂量和脑复康组作用为优，对比组之间的差异具有统计学意义（P0.05）。4 讨 论 衰老性老年痴呆病属中医学“呆病”的范畴。古今医家认为脾肾两虚、肾精不足、髓海空虚，兼有痰瘀互阻为老年痴呆病的基本病机。抗衰益智胶囊是由出自医方集解的“还少丹”化裁而来，是国家将级名中医周信有教授根据衰老性老年痴呆病机内涵及多年运用还少丹的临床经验，于

20、还少丹方中减去小茴香、杜仲、怀牛膝、楮实子、大枣、五味子，并加入人参、黄芪、麝香、三七、地龙、胆南星等药组方，共奏补肾健脾、祛痰开窍及活血益智之功；前期研究表明抗衰益智胶囊具有对抗氧自由基，减轻脑神经元损伤而干预老年痴呆的作用6。现代研究表明7衰老性老年痴呆的早期症状以记忆障碍为主要特征，而记忆障碍与胆碱能递质失衡密切相关，衰老患者最具特征的神经生化方面的改变为大脑皮质、海马中乙酰胆碱（Ach）含量的显著减少，胆碱乙酰转移酶（ChAT）活性降低，乙酰胆碱酯酶（AchE）活性增高。Ach是中枢胆碱能神经系统重要的神经递质，其信号传导和认知、学习记忆密切相关。Ach由ChAT化合成，ChAT是生成

21、Ach的限速酶，常作为研究胆碱能神经元的标志或估计Ach含量（释放量）的间接指标。Ach由AchE催化分解，通过Ach受体发挥生物学效应，ChAT和AchE同维持着Ach的动态平衡，由于脑内Ach水平与ChAT的活性呈正相关，和AchE活性呈负相关8，故研究中广泛使用ChAT /AchE的活性间接反映脑组织内Ach水平以评估机体大脑认知、学习记忆功能。同时机体衰老特别是脑衰老的发生与中枢神经系统单胺类神经递质代谢紊乱相关 9-10，从而出现相应的脑老化及衰老现象。中枢单胺类神经系统作为最重要的中枢递质系统，其神经递质包括多巴胺、去甲肾上腺和5-羟色胺等，具有广泛的生物学效应。研究表明11脑内DA系统与躯体运动、行为、觉醒、情感等的调节有关，表现为整体行为兴奋作用，并参与记忆痕的再现。NE能神经元参与调整整个大脑皮层兴奋状态，对觉醒、感觉、情绪和高级认知功能产生广泛的影响。中枢5-HT对睡眠调节起主导作用，并与精神活动、感觉体温调节、高级认知功能有关。但随着年龄的增加，中枢神经递质含量发生明显变化，DA、NE、5-HT等神经递质的活性和转换率有不同程度的降低，从而出现学习、情绪和高级认知功能等障碍。本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠脑组织内AchE活性升高，ChAT活性降低；NE、DA、5-HT含量降低，说明衰老大鼠脑内组织单胺类和胆碱能神