抗菌肽的研究进展

1、 抗菌肽的研究进展 摘要：由于细菌对抗生素耐药性不断出现, 研发新型抗菌物质已迫在眉睫。而抗菌肽是广泛存在于自然界生物中的具有广谱抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的多肽 。本文介绍了抗菌肽的结构，抗菌肽的生物学活性，抗菌肽的作用机理和作用机制，以及抗菌肽的应用和前景。关键词：耐药性，抗菌肽；作用机理；前景 抗菌肽，简称ABP,是由宿主产生的一类能够抵抗外界病原体感染的小分子多肽。广泛存在于各种生物体内。1980 年 ，瑞典科学家 Boman 等从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素( cecropin ) 抗菌肽，使人们对抗菌肽 的作 用机理和应用有了一个崭新的认识。目前世界上已知的抗菌肽共有1

2、 700余种。由于热稳定性强，且对较高离子强度环境有较强的适应性，不仅有广谱抗细菌能力, 而且有的对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用，最重要的是可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又极少破坏动物体内的正常细胞，因此 ，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外昆虫学 、生理学 、药理学研究热点 ，在动植物转基因工程及药物开发领域及农业、食品等领域具有广阔的应用前景 。1 .抗菌肽的结构1 .1 一级结构据报道，已分离并测定其氨基酸序列一级结构的抗菌肽达几十种 ，且一级结构 都比较相似 ，具有以下典型的特征：由2070多个氨基酸残基组成的肽链 ， 其N 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨 基酸 ，C 端富含

3、丙氨酸 、缬氨酸 、甘氨酸等非极性氨基酸 ，中间部分则富含脯氨酸 ，且在许多特定位置都有一些 较保守的氨基酸残基 ，这些高度保守的氨基酸残基是一些抗菌肽分子具有抗菌 活性所不可缺少的 ，1. 2 二级结构 通过圆二色性分析、二维核磁共振谱法及脂质体模拟实验研究抗菌肽的二级结 构特征，结果表明 ，抗菌肽在一 定条件下形 成a-螺 旋和-折叠 结构 。a-螺旋是 一个近乎完美的水脂两亲结构,即圆柱形分子的纵轴一边为带正电-的亲水区，而对称面为疏水区。这种两亲性结构是抗菌肽杀菌的关键 ，改变a-螺旋的螺旋度会影响抗菌肽的活性。抗菌肽有许多保守序列,在N端易形成a-螺旋,中间部 分 易形 成 -折叠或

4、铰链 。a-螺旋肽主要包括 天蚕 素 、爪蟾抗 菌肽 ma g a i n i n 、c a t h e l i n d i a 等 ，-折叠肽主要包括哺乳动物防御素、植物防御素、昆虫防御素和富含脯氨酸的抗菌肽等。2 抗菌肽的来源2.1微生物抗菌肽微生物抗菌肽包括病毒源和细菌源，最早发现的病毒源抗菌肽是人类免疫缺陷病毒 1( H IV 1 ) 包膜蛋白胞质尾部, 与其他慢性病毒的穿膜蛋白的抗菌肽一样, 同样具备抗菌活性和细胞毒性（特点：这类抗菌肽的精氨酸含量高, 不含有赖氨酸）。细菌自身也能抗菌肽，目前发现细菌抗菌肽有杆菌肽（Bacitrcins）（Reiko et al，2003）、短杆菌肽

5、S（Kazuko1997）、多粘菌素E(Polymyxin E）（Ronald et al ，2005）和Nisin等四种类型，革兰阳性菌和革兰阴性菌都可分泌（特点：中性肽和阳离子肽）。2.2动物抗菌肽的来源动物抗菌肽包括无脊椎动物和脊椎动物抗菌肽2.2.1无脊椎动物抗菌肽昆虫源抗菌肽，是昆虫遭受刺激或感染后, 由血淋巴产生的一类多肽, 具备广谱抗菌活性。分为4 种: 不含半胱氨酸残基的抗菌肽( 代表物为天蚕素（Cecropins）（Steiner et al，1981) ; 富含半胱氨酸残基的碱性多肽( 代表物为防御素、死亡素) ; 富含甘氨酸残基的抗菌肽( 代表物为双翅肽、攻击素）; 富含

6、脯氨酸残基的抗菌肽( 代表物为蜜蜂肽）。鱼类抗菌肽，从不同鱼类中分离大量的抗菌肽，例如从八目鳗类鱼肠道可以分离到抗菌肽HEIAPs(Basanez et al，2002），它是一族具有膜穿透活性的光谱阳离子抗菌肽。贝类抗菌肽，根据目前已发现的贻贝抗菌肽的一级结构和性质可分为贻贝素( mytilin) 、 贻贝肽( my ticin) 、 防御素( defens in) 和贻贝 霉素( mytimycin) 等4 类, 并且均是小分子多肽。 此种抗菌肽能够抑制移植性肿瘤的生长, 使得小鼠的存活时间延长（毛文君,2010)。其他节肢动物抗菌肽，例如从蝎子分离到Androctonin（Ehret e

7、t al，1996），从狼蛛的毒腺中分离到一族 螺旋抗菌肽Oxyopinins，它们具有抗菌活性，溶血活性和杀虫剂作用（Corzo et al,2002)等2.2.2脊椎动物抗菌肽哺乳动物抗菌肽，例如人类的包括由4个颗粒白细胞表达6个-防御素和胸腺依赖性细胞表达的人嗜中性粒细胞肽HNPI-4(Bals et al，2004），以及牛获得的Bac-5和Bac-7（Risso et al，2002）鸟类抗菌肽 ，多属于-防御素类，例如从鸡中分离到四种抗菌肽Gal-1/CHP1、Gal-1/CHP2、Gal-2和 Gal-3（Zhao et al，2004）。两栖动物抗菌肽，目前已从 600余种两栖

8、类皮肤中分离得百余种抗菌肽, 例如蛙肽、 爪蛙肽等。2.3植物抗菌肽植物性抗菌肽,迄今已有8个家族抗菌肽在植物中被发现, 即 thionins、displayhevein、 plantdefensins、lipoid transfer pro teins、IbAMP、 knottinlike、molting hormone 和 M BP 1 （玉米种子中分离），特点：植物源抗菌肽均含有大量半胱氨酸,并形成 2 个 6 个分子的二硫键稳定结构。与动物源和细菌源抗菌肽比较, 植物源抗菌肽对于真菌具有很高的抑杀活性3抗菌肽的作用机理3.1膜结合型学说3.1.1孔洞学说：这种模型是Cruciani（1

9、992）等根据天蚕素和蛙皮素的作用机制的研究提出的，具体内容是抗菌肽作用于负电荷的细菌膜磷脂头部，然后疏水性的C末端插入膜中，两亲性的-螺旋置于界面，当大量抗菌肽分子与细胞膜结合，使得膜两侧电位升高，导致去极化，膜破裂（吴希等，2005）3.1.2地毯模式学说：其内容是：覆盖在膜表面的抗菌肽分子发生旋转，引起疏水性残基方向改变从而趋于质膜疏水性核心，破坏质膜双磷脂层，导致内容物外泄，细菌死亡。（Shai et al，2001）3.2非膜结合型学说有些通过复杂的机制抑制靶细胞壁组分的合成，导致细菌不能维持正常形态，生长受阻，如Sarcotoxins II (Wiker et al，1990）有些

10、通过抑制细胞呼吸，达到杀菌目的，如Thanatin（Wu et al，2011)有些是通过抑制细胞外膜蛋白的合成，导致细胞死亡，如Attacin(Ojo et al,2013)4 抗菌肽的生物活性4.1抗菌作用一般来讲 ，具有广谱抗细菌活性，抗菌肽的抗菌活性都较高，单种抗菌肽可抑杀多种细菌，能够抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 ， 但不同抗菌肽的菌活性存在较大差异 ， 抗菌谱也明显不同 。 抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性，不同抗菌肽之间以及抗菌肽与传统抗生素之间具协同作用 。同时也具有抗真菌的作用，如天蚕素在25100mgL时对曲霉属和镰刀菌属的病原菌有杀灭作 用（Delucca，1997）

11、； 人和灵长类动物唾液的组蛋白也有抗真菌作用 ，它与真菌细胞的包膜受体结合后进人其部并定位于线粒体 ；兔防御素 NP l 、植物防御素对多种植物致病真菌具有杀伤作用。4.2抗病毒作用除昆虫抗菌肽外 ， Egal等发现人工合成的magainins模拟肽对疱疹病毒有抑制作用 。Wachinger - 1 于1998年报道的研究结果表明 ， 蜂毒素和天蚕素可以在 亚毒性浓度下抑制艾滋病毒HIV一1的基因表 达 ， 从而减少HIV一1的增殖。这表明抗菌肽对于当今人类的顽症一 艾滋病也有抑制作用 。对于抗菌肽的抗病毒潜能的研究，有重大意义。4.3抗寄生虫作用 抗菌肽可以有效地杀死寄生虫，如疟疾、莱什曼病

12、等（于娟等，2008）。目前发现一种合成的天蚕素-蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭虫有损伤作用，起作用的靶位点是细胞质膜，它可以破坏膜电势，质膜形态也会受到破坏。研究还发现原虫抗菌肽对疟原虫发育的不同时期有不同的作用，主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显的损伤。4.4抗肿瘤作用其作用主要是使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体出现空泡化，致使核膜破损，核染色体断裂，癌细胞骨架断裂等。黄自然等研究证实柞蚕抗菌肽D对人直肠癌细胞有杀伤作用（黄自然等，1999）爪蛙素Temporin（Rinaldi et al，2001）、鼠天蚕素抗菌肽NP-1和NP-2及天蚕素抗菌肽HNP-1均表现出对肿瘤细胞如纤维

13、瘤细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞等的杀伤作用，可见抗菌肽在医药方面的发展潜力。5抗菌肽的分离与合成要把抗菌肽从实验室推广到临床阶段，需要解决现实抗菌肽分离与合成的难题，目前，已知的方法有三种5.1直接提取法如直接用从蛙皮肤中浸提，缺点是来源有限，成本昂贵，操作粗放，活性蛋白率低，含量低。5.2化学合成法采用多肽的固相合成技术和组合化学进行，缺点是操作复杂，成本高，对环境有污染。5.3基因工程法利用基因工程的方法，有希望进行大规模生产。但是由于抗菌肽容易被宿主细胞分解，且对宿主菌有杀伤作用；抗菌肽分子量较小，难分离纯化等问题，抗菌肽生产需要解决方法。目前已知，针对抗菌肽具有抗菌活性，需消除或减少对宿

14、主菌的杀伤作用。当前主要采用融合表达抗菌肽的方法来解决，即在N端或者C端添加一段融合标签，这段标签未切除前可以使蛋白减少或者没有活性。融合标签和抗菌肽基因之间加入切割识别标记，这些标记常见的有甲硫氨酸标记和TEV蛋白酶切位点标记等，其中，可用溴化氰特异识别肽链C末端的甲硫氨酸，TEV酶可以特异性识别ENLYFQ氨基酸序列，从而把它们切开（Sun et al,2012)。目前的融合标签大致分为有两种，一种是单纯为了优化抗菌肽的表达状况，可以选择GST、TrX、GFP、MBP以及分子伴侣等（Maya Bar et al，2006）另一种是抗菌肽与其他具有相同作用对象的蛋白分子共表达，或者将抗菌肽分

15、子串联一起表达，最终可以同时合成两种及以上活性蛋白分子。例沈益等（2007）将抗菌肽Cecropin基因多拷贝串联体与TNF基因（天然型肿瘤坏死因子）融合表达，得到一种复合蛋白因子。针对抗菌肽分子量较小，难分离纯化，如何进行发酵等下游处理尤为困难。目前在实验室构建表达载体时，在抗菌肽基因上游或下游插入6xHis标签，然后在表达结束后，利用镍离子亲和层析的方法获取目的蛋白（夏海峰等，2010）。现在研究表明，在抗菌肽基因前加入表达出组氨酸标签的融合蛋白不仅没有降低活性，而且会使活性增加（牛明福等，2008）6抗菌肽的应用6.1在医药上的应用由于抗生素的滥用导致耐药菌株的出现，以及药物残留等公共卫

16、生问题，抗菌肽的研究越来越成为焦点。乳酸链球菌素（Nision）在治疗幽门螺旋杆菌引起的胃溃疡时效果显著，对链球菌、葡萄球菌、芽孢杆菌及其它乳酸菌有抑制作用，Nisin已被美国FDA批准为血液防腐添加成分。6.2在农业上应用在农业方面的应用在转基因植物方面，青枯病在中国南方各省市均有发生，其可导致大面积的作物和树木死亡，美国路易斯安纳州大学已将抗菌肽Shiva-I基因转入烟草和马铃薯，使转基因烟草青枯病发病明显延迟，植物死亡率降低；抗青枯病的转基因辣椒和番茄也有成功报道（高媛媛等，2007；李颖等，2005）在畜牧生产上，抗生素类促生长添加剂在饲料中的长期使用所带来的耐药性 、药物残留和环境污

17、染等问题已越来越受到人们的关注，抗菌肽作为新兴环保型饲料添加剂越来越得到重视，不少研究者做了一些相关的试验，得到了较好的结果。马卫明等检测了猪小肠抗菌肽对鸡大肠杆菌 (O1)C83845 株 、鸡白痢沙门氏菌 C79-13株、大肠杆菌 (O2) 、 大肠杆菌 (O78) 、猪致病性大肠杆菌自然分离株 、 鸡致病性大肠杆菌自然分离株 、白色葡萄球菌 、金黄色葡萄球菌 ATCC25923 株 、 猪致病性沙门氏菌自然分离株 、 绿脓杆菌 ATCC27853株、鱼致病性嗜水气单胞菌等 11 株细菌的作用 。 结果发现 ， 猪小肠抗菌肽对以上各株细菌均有不同程度的抑制作用，杀菌率 59.5%98.5%

18、不等。可见抗菌肽在饲料市场前景广阔。6.3在食品中的应用由于抗菌肽杀菌谱广，活性高，可以较强地杀灭与食品污染有关的多种革兰氏阴性和阳性细菌，而且抗菌肽热稳定性好，可以用于热加工食品的防腐以及防止巴氏杀菌后再污染，由于部分抗菌肽易被人体内蛋白酶分解，对人无毒副作用，可以做饮料的防腐。目前抗菌肽在食品工业上主要作为保藏剂，如从乳酸菌中分离到的抗菌肽用作食品保藏剂；鱼类抗菌肽不仅可以抗菌，它的营养价值还有美容价值，在化妆品应用方面具有独特的优势和广阔的市场.7问题与展望抗菌肽抗菌谱广，特别是对多重耐药菌具有杀伤作用 ， 而且抗菌肽热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用，抗菌肽在农业、

19、食品、医药表现出很大的潜力价值，因此，目前抗菌肽成为国内外研究和开发的热点。但抗菌肽仍存在着许多尚待解决的问题：构建基因工程菌如何提高表达量 ；抗菌肽的毒性作用，尽管绝大多数的抗菌肽是无毒的或者毒性较低 ，但有些阳离子抗菌肽可对哺乳动物细胞产生巨大的毒性作用。而且与抗菌肽相关的更多的极微的毒性作用还没有研究 。抗菌肽的稳定性和免疫反应问题 ，这就要对抗菌肽进行分子改造 ，使之既能抵抗蛋白酶分解 ，又不会产生强烈的抗原性 。 这就需要更好的运用基因工程技术以及发酵技术以及相关的生物、化学、免疫等方法去解决，相信抗菌肽在未来的人们生活中将会发挥越来越多的作用。参考文献1刘诚. 抗 菌 肽 的 研 究 进 展. 动 物 医 学 进 展, 2011, 32( 3) : 94-992李 波，刘 明. . .抗 菌 肽 的 最 新 研 究 进 展. 北 方 牧 业 报，2009, 33(4):43-46 3 刘 倚 帆 ， 徐 良， 朱 海 燕 ， 等 抗 菌 肽 与