第四章DNA的复制2

1、DNA的复制 DNA Replication 讲授：陈友讲授：陈友生物科学与技术学院生物科学与技术学院2014/3/312014/3/31半保留复制的意义半保留复制的意义保证了物种遗传的稳定性保证了物种遗传的稳定性( (高保真性、保守性高保真性、保守性) )？是物种稳定的分子基础，但不是绝对的。是物种稳定的分子基础，但不是绝对的。 按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNADNA与亲代与亲代DNADNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的稳定性。全部遗传信息，体现了遗传的稳定性。 半连续复制的意义半连续复制的意义解决了解决了DN

2、A复制过程中两条链同时沿着复制过程中两条链同时沿着复制叉方向移动的问题。复制叉方向移动的问题。DNA聚合酶聚合酶III-形成不对称的二聚体形成不对称的二聚体 使前导链、滞后链的合成可同时进行使前导链、滞后链的合成可同时进行提高酶持续提高酶持续合成能力合成能力3-53-5外切酶外切酶校对功能校对功能核心酶二核心酶二聚化聚化组建核工组建核工业心酶业心酶5-35-3合成合成DNADNA的催的催化活性化活性夹子装配夹子装配器，协同器，协同亚基嵌亚基嵌住模板住模板DNADNA教学重点教学重点 参与复制的主要物质及其作用DNA复制的起始、延伸和终止（以E.coli为例）教学难点教学难点 DNA复制的起始、

3、延伸和终止（以E.coli为例）“”型复制型复制 环状环状DNA的复制方式，即从复制起点开始，的复制方式，即从复制起点开始，双向同时进行，形成双向同时进行，形成样中间物样中间物环节： DNA复制的起始 DNA链的延伸 DNA复制的终止 第二节第二节 细菌细菌DNA复制复制一、细菌一、细菌DNA复制起始复制起始 （一）复制起始复合体（一）复制起始复合体 DnaADnaA（起始点结合蛋白，识别起始序列，（起始点结合蛋白，识别起始序列， 在起点特异位置解开双链在起点特异位置解开双链) )DnaBDnaB（解旋酶，解开（解旋酶，解开DNADNA双链）双链）DnaCDnaC（装载解旋酶和引发酶，帮助（装

4、载解旋酶和引发酶，帮助B B结合于起点）结合于起点）DnaGDnaG （引物合酶，合成（引物合酶，合成RNARNA引物）引物）SSB SSB （单链结合蛋白，具有协同性效应）（单链结合蛋白，具有协同性效应） HUHU（类组蛋白，识别并刺激（类组蛋白，识别并刺激OriCOriC 形成开链）形成开链）拓扑异构酶拓扑异构酶（释放（释放DNADNA解链过程中产生的扭曲张力）解链过程中产生的扭曲张力）RNARNA聚合酶（促进聚合酶（促进DnaADnaA的活性的活性）（二）复制起始区的结构特点（二）复制起始区的结构特点 1 1、富含、富含AT 2 2、3 3个个13bp13bp的重复序列的重复序列-解链的

5、位点解链的位点 3 3、4 4个个9bp9bp的重复序列的重复序列- DnaA结合位点结合位点（三）复制起始引发的过程：（三）复制起始引发的过程： 1、DNA复制起点双链解开复制起点双链解开 ，形成复制叉形成复制叉GATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaA+ATPDnaBDnaCOriC（富含（富含AT）313bp重复序列重复序列49bp重复序列重复序列 DnaA结合位点结合位点HU +ATPATP过程：过程：（1）约）约20个个DnaA结合在结合在49bp重复序列重复序列（2）DnaA复制起始复合物使复制起始复合物使13bp重复序列变性，重复序列变性， 形成开链形成开链（3 ）Dn

6、aB与单链与单链DNA结合（需要结合（需要DnaC帮助），帮助）， 进一步解开进一步解开DNA双链，形成复制叉双链，形成复制叉2、RNA引物的合成引物的合成 leading strand: primase（引发酶）（引发酶） lagging strand: primosome 引发体（引发前体引发体（引发前体primase） 引发前体：引发前体：n蛋白、蛋白、n蛋白、蛋白、n”蛋白、蛋白、i蛋白、蛋白、 dnaB蛋白和蛋白和dnaC蛋白蛋白 3、DNA聚合酶将第一个dNTP加到引物的3-OH末端 SSBDnaGprimaseDnaBhelicasePol III （ /）引发体（引发体（pri

7、mosome）Pol I、ligase复制体（复制体（replisome）in vivo 二、细菌二、细菌DNA复制延伸复制延伸（二）（二）DNA聚合反应的特征聚合反应的特征1、DNA的聚合反应是以的聚合反应是以dNTP为底物，以为底物，以3 5 DNA为模板，按碱基配对原则在为模板，按碱基配对原则在3-OH上加上加dNTP （DNA聚合酶对碱基的选择功能）聚合酶对碱基的选择功能）2、需二价正离子如、需二价正离子如Mg， 3-OH作亲核进攻形成磷酸作亲核进攻形成磷酸 二酯键二酯键3、链沿、链沿5 3方向延长方向延长4、碱基互补配对，若错配则切除掉、碱基互补配对，若错配则切除掉（一）（一）DNA

8、复制体复制体(replisome) DNA聚合酶聚合酶全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体（三）防止拓扑学问题（三）防止拓扑学问题两种机制两种机制1DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和2DNA拓扑异构酶可以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；DNA拓扑异构酶(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA nick结合结合Pol I引物移动引物移动 / DNA合成合成封闭缺口封闭缺口降解的引物降解的引物DNA ligase（四）缺刻平移（四）缺刻平移( Nick transla

9、tion)去除引物去除引物5533parentprogenyAATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCAterE / terD / terAterC / terB / terFReplication fork 1Replication fork 2tus gene 产物产物复制终止区：复制终止区：200 kb（DnaB inhibitor)复制叉相遇位点复制叉相遇位点三、细菌三、细菌DNA复制的终止复制的终止Topoisomerase IV：使复制叉解体，释放子链使复制叉解体，释放子链DNA（三）分离（三）分离（segregation）（一）终止

10、位点（一）终止位点 一侧复制叉的终止位点位于相遇点的另一侧一侧复制叉的终止位点位于相遇点的另一侧 （二）终止机制（二）终止机制 1、Tus蛋白的作用：蛋白的作用： 可与终止序列结合，阻止复制叉继续前移可与终止序列结合，阻止复制叉继续前移 2、两个复制叉在相遇点相遇、两个复制叉在相遇点相遇 3、两个复制叉在复制快的复制叉的终止点相遇、两个复制叉在复制快的复制叉的终止点相遇 4、最后、最后50100bp由修复方式填补空缺由修复方式填补空缺过程 酶和蛋白 作用 备注起始解链酶 解开DNA双链模板 拓扑异构酶 松驰超螺旋 SSB(DBP) 防止复性防止被水解 引物酶 合成RNA引物 RNA引物 延长D

11、NA-pol DNA链的延伸、校读 底物dNTP 终止DNA-pol 切除引物,填补空隙,校读 DNA连接酶 连接DNA片段 拓扑异构酶 引负超螺旋 酶和蛋白 小结小结1 1：E.coliE.coli （原核生物）（原核生物）DNADNA复制复制 第三节第三节 真核生物真核生物DNA复制复制一、概述（一）复制与细胞周期（一）复制与细胞周期 S期 早：常染色质，早：常染色质， 中：异染色质，中：异染色质， 晚：着丝粒和端粒晚：着丝粒和端粒（二）复制频率（二）复制频率 每个细胞周期复制一次每个细胞周期复制一次（三）复制与核小体（三）复制与核小体 1、 复制叉形成时复制叉形成时DNA从核小从核小体解

12、离，组蛋白八聚体解聚体解离，组蛋白八聚体解聚 2、复制叉通过后新、旧组蛋、复制叉通过后新、旧组蛋白与白与DNA重新组装成核小体重新组装成核小体成熟前起始成熟前起始（快速生长的（快速生长的原核细胞原核细胞内）内）二、真核生物二、真核生物DNA复制的起始复制的起始（一）复制起始点（多个）（一）复制起始点（多个）酵母：自动复制序列酵母：自动复制序列 （ARS） 特点：特点：11bp的保守序列（富含的保守序列（富含AT） （起始位点识别复合体（起始位点识别复合体 ORC）（二）复制子簇（二）复制子簇（cluster of replicons） 特点特点 1 1、由多个复制子组成、由多个复制子组成，20

13、-50个串联排列个串联排列 2 2、同一、同一复制子簇复制子簇内的复制子基本同步起始内的复制子基本同步起始三、真核生物三、真核生物DNA复制的延伸复制的延伸（一）相关酶和蛋白质（一）相关酶和蛋白质 1、解旋酶（、解旋酶（RP-A，replication protein A） 2、单链结合蛋白、单链结合蛋白 3、连接酶连接酶 I（DNA ligase I） 4、PCNA（proliferating cell nuclear antigen） -增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原 与与Pol 向向Pol 的转换的转换有关有关 5、聚合酶、聚合酶（二）真核生物（二）真核生物DNA聚合酶聚合酶 1、 DNA

14、 Pol （作用：复制的引发）（作用：复制的引发） 复合体（复合体（ Pol /引发酶）引发酶） （1）引发酶活性）引发酶活性 合成前导链和每个后随链每个片段的合成前导链和每个后随链每个片段的RNA引物引物 （2）53聚合酶活性聚合酶活性 可继续延长可继续延长DNA（a few hundred nt）但很快）但很快 被被 Pol 代替代替 2、 DNA Pol （作用：前导链、滞后链延长，校对功（作用：前导链、滞后链延长，校对功能）能） （1） 53聚合酶活性聚合酶活性 （2） 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性四、真核生物四、真核生物DNA复制的终止复制的终止 1、终止位点：、终止位点：

15、不存在使复制叉终止和解聚的终止位点不存在使复制叉终止和解聚的终止位点(Termini) 2、终止机制：、终止机制： 复制终止通过复制叉的相遇而终止复制终止通过复制叉的相遇而终止五、真核生物染色体五、真核生物染色体 DNA末端复制末端复制（一）（一）端粒（端粒（Telomere） 1、概念：、概念：是真核生物染色体末端的是真核生物染色体末端的一种特殊结构一种特殊结构 2、组成：端粒、组成：端粒DNA / 端粒蛋白端粒蛋白 （1）端粒蛋白）端粒蛋白 ：非组蛋白：非组蛋白 （2）端粒）端粒DNA ： a、含数百个短的正向重复序列，富含含数百个短的正向重复序列，富含GC b、通式：、通式：Cn（A/T

16、）m n 1，m=1-4人的端粒人的端粒DNA序列：序列：（TTAGGG）n3、作用作用 （1）稳定染色体结构稳定染色体结构 （2）防止染色体末端融合）防止染色体末端融合 （3）保护染色体结构基因）保护染色体结构基因 （4）避免遗传信息在复制过程中丢失避免遗传信息在复制过程中丢失附：附：端粒长度端粒长度-分子钟分子钟(molecularclock) 的作用的作用 随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当 达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性， 阻止细胞进一步分裂的信号便发出。细胞将发阻止细胞进一步分裂的信号便

17、发出。细胞将发 生凋亡（生凋亡（apoptosis）（二）端粒酶（二）端粒酶 1、组成组成 （1 1）蛋白质：逆转录酶）蛋白质：逆转录酶 （2 2）RNA：约：约150150nt，部分序列与端粒，部分序列与端粒DNA互补，互补， 可作为合成端粒可作为合成端粒DNA的模板的模板 （端粒酶是自身携带（端粒酶是自身携带RNA模板的逆转录酶）模板的逆转录酶） 2、功能：负责端粒功能：负责端粒DNADNA的延长，维持端粒的长度的延长，维持端粒的长度3 3、存在部位：、存在部位： 在在干细胞干细胞、生殖细胞生殖细胞和和肿瘤细胞肿瘤细胞， 才可以检测到具有活性的端粒酶才可以检测到具有活性的端粒酶4 4、端粒

18、酶、端粒酶和衰老、肿瘤有关和衰老、肿瘤有关（三）端粒（三）端粒DNA的复制的复制 1、已存在的端粒、已存在的端粒DNA的复制：的复制： 与其它部分与其它部分DNA复制一起完成复制一起完成 2、端粒、端粒DNA的延长的延长 主要由端粒酶完成主要由端粒酶完成 （1）G链（链（G-rich strand）的合成）的合成 （2）C链（链（C-rich strand）的合成）的合成.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC AACCCCAAC5335dGTP.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT.AACCCCAACCCC AACCCCAAC5335dGTP.T

19、TGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC AACCCCAAC53353RNA template（1）G链的合成链的合成G链的合成链的合成 1 端粒酶与端粒端粒酶与端粒DNA结合，端粒中的结合，端粒中的RNA与凸出的与凸出的 G链链3端的端的TTG配对配对 2 以端粒酶的以端粒酶的RNA为模板，在为模板，在G链链3从头合成从头合成DNA 3 延伸延伸6个核苷酸个核苷酸 合成一个重复单位后，端粒酶向新合成的合成一个重复单位后，端粒酶向新合成的DNA 3端移动，端粒酶中的端移动，端粒酶中的RNA再与再与3端的端的TTG配对。进配对。进行多个循环，行多个循环，G链

20、链3端形成多个短的重复序列端形成多个短的重复序列（2）C链的合成链的合成 两个模型两个模型a、G链末端回折，形成发夹结构；链末端回折，形成发夹结构；DNA聚合酶延伸聚合酶延伸b、 Pol a /引发酶引发酶合成合成RNA引物引物; pol a 延伸延伸;primaseprimase.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC CCCCAAC53.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC CAACCCCAAC53.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC CCAACCC CAACCCCAAC53.TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG.AACCCCAACCCC AACCCCAACCC53DNA polymerase引物合成引物合成延伸延伸引物切除引物切除35C链的合成链的合成 1 引发酶以引发酶以G链链3端为模板合成一段引物端为模板合成一段引物 2 DNA聚合酶以聚合酶以G链为模板，补齐链为模板，补齐C链缺口链缺口 3 去除引物，在去除引物，在G链链3端留下一个