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文档简介

1、TALEN活性检测与基因型鉴定苏幼红2021.3.2基因敲除大鼠技术流程基因敲除大鼠技术流程.一、 TALEN活性检测1.细胞转染2.测序套峰实验3. 错配酶实验.流程C6细胞转染TALEN pair提取基因组PCR扩增靶位点测序错配酶实验.1. TALEN转染C6细胞 构建好的TALEN质粒成对转染细胞详见SOP。 收细胞基因组，PCR扩增目的基因片段。.2. 2. 测序实验测序实验PCR并将产物送测序，测序结果分析，举例如下：Rag2 wtTALEN Rag2-38.3. 3. 错配酶实验错配酶实验 (MSD assay)- (MSD assay)-原理及流程原理及流程错配酶：一类可识别并

2、切割异源DNA错误配对位点的内切酶。NEB：T7EI5-tgcccagcagcagcggccttacggctatgagcaggca agctttgtgggtgctctgccga-3 3- acgggtcgtcgtcgccggaa tgccgatactcgtccgt tcgaaacacccacgagacggct -5TALEN-L target seq. TALEN-R target seq.SpacerF1R1E2E3E4Fragment 1Fragment 2.PCR扩增目的基因片段PCR产物纯化纯化产物变性、退火错配酶切退火产物.UncleavedTALEN dependent bandw

3、t 39 41 55 64 66 78 89 99 91 38 wt 39 41 55 64 66 78 89 99 91 38 ApoA4 Rag2 ApoA4 Rag2T7EI-T7EI+3. 3. 错配酶检测错配酶检测 (MSD assay) - (MSD assay) - 结果例如结果例如.错配酶检测MSD assay结果分析.Origin Pro.二、 F0代基因型鉴定测序.峰图：有无套峰？有无序列比对野生型纯合复制套峰左侧的单峰序列，在基因组中寻觅位置，在双峰中能否找到下游WT序列？2种峰嵌合双峰能找到双峰中非WT序列在基因组的位置单克隆测序缺失杂合/嵌合根据峰高杂合/嵌合；插入/

4、(插入+缺失)双等位基因的不同修饰注：无法完全分辨杂合与嵌合能否否鼠尾基因组提取及PCR测序结果分析.野生型野生型.缺失纯合 Rat NO.16WTRat NO.16WTRat NO.16WT.嵌合2峰 .缺失杂合/嵌合？ WTRat NO.6WT G C C T T A A T T C A A C C A T C A T C T C A A A C T G .插入杂合？WT C T C C T G G C T G C T G C G C T C C T G G C T G C T G .插入+缺失?WT G A G A C A T T T T C A T G C T A G A C A T A C A C T T G C T T G G A A.F0代SD鼠优先选择原那么普通为：纯合 杂合 嵌

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