链霉菌操作手册

1、链霉菌室实验操作手册（2003年）第一章 培养基 抗生素 生长因子3常用抗生素及其使用浓度3LB（Luria-Bertani）培养基3LA3基本培养基（MM）3R5（1L）链霉菌原生质体转化时用4YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌）4TSBY （1L）（液体培养链霉菌）4MS培养基52CMY培养基（用于井岗的接合转移）5YMS培养基（阿维，井岗产孢）5YD培养基5生长因子补充物的使用浓度5第二章 DNA基本操作7大肠杆菌质粒的抽提7酶连反应7DNA片段凝胶回收7DNA纯化9E.coil总DNA的提取9链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进）10去磷酸化处理（详见分子克隆实验指

2、南以及Takara的CIAP使用说明）10AT克隆（详见说明书）10Southern Blot11第三章 PCR及相关技术13PCR13PCR重组（详见PCR技术实验指南p429 重叠延伸技术）14PCR定点诱变（DpnI法）14第四章 基因片段转移技术15大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化15DNA转化15大肠杆菌质粒的快速检测15接合转移（详见英文手册249页）16链霉菌原生质体的制备16链霉菌原生质体的转化17PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化17第五章 RNA操作技术19链霉菌总RNA的抽提19链霉菌的RT-PCR（promega RT

3、kit）19第六章 蛋白质基本操作技术21SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色21大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）：21链霉菌总蛋白抽提：22大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）：22Western Blot23第七章 遗传作图相关技术25链霉菌孢子悬液的制备25链霉菌中NF的证明25孢子杂交25在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因25第八章 其他技术27链霉菌菌种保藏27检测链霉菌淀粉酶的活性27第一章 培养基 抗生素 生长因子常用抗生素及其使用浓度 抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度

4、（g/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, Amp Chloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrermEaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?5010510010R25

5、5050251050R502.55050-1002550505025不敏感2030-50* 表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨 10g，酵母抽提物 5g，NaCl 5g，葡萄糖 1g，蒸馏水加至 1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的

6、琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺 0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g, 蒸馏水至 1000ml 将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 蔗糖 103g K2SO4 0.25g MgCl2·6H2O 10.12g 葡萄糖 1

7、0g Difco酪蛋白氨基酸 0.1g 微量元素溶液 2ml Oxoid酵母提取物 5g TES 5.73g 加蒸馏水至 1000ml称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。使用时，将培养基融化，每瓶中加入： KH2PO4(0.5%) 2.5ml CaCl2·2H2O(5M) 1ml L-脯氨酸(20%) 3.75ml NaOH(1M)调pH至7.3 对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考手册）YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌） Oxoid酵母提取物 3g Oxoid蛋白胨Try

8、ptone 5g 麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630） 3g 葡萄糖 10g 蔗糖 340g 蒸馏水 至1000ml高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113114C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。） MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L制备原生质体时，还要加入： 甘氨酸（20%） 25ml/L 蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。 甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。TSBY （1L）（液体培养链霉菌） Oxoid胰胨豆汤粉（TSB） 30g 蔗糖 340g Oxoid酵母抽提物

9、5g 蒸馏水 至1000ml*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。MS培养基将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g 甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。2CMY培养基（用于井岗的接合转移）可溶性淀粉 10g 胰蛋白胨 2gNaCl 1g(NH4 )2SO4 2gK2 HPO4 1gCaCO3 2g无机盐溶液* 1 ml琼脂 20g蒸镏水 1000 mlPH7.2无机盐溶液(每升)FeSO4 .7H2 O 1gMgCl.6 H2 O 1gZnSO4. 7H2 O 1gYM

10、S培养基（阿维，井岗产孢）酵母抽提物 4g可溶性淀粉 4g麦芽糖 10gCoCl. .6 H2 O 5mg琼脂 20g蒸镏水 1000 mlPH7.2YD培养基酵母抽提物 4g麦芽糖 10g葡萄糖 4gMgCl 2gCaCl 1.5g琼脂 15g蒸镏水 1000 mlPH7.2生长因子补充物的使用浓度 天蓝色链霉菌1258 、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表生长因子补充物的使用浓度表化合物储存液（mg/ml）1终作用浓度（g/ml）组氨酸（Histidine）1050其它氨基酸27.537腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶1.57.5维生素

11、0.10.51. 储存液用无菌去离子水配置，8磅灭菌后4oC保存。2. 对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。第二章 DNA基本操作大肠杆菌质粒的抽提苯酚/氯仿溶液抽提法1. 接种5ml LB，37摇床过夜培养（12小时）2. 离心，3000rpm，5min去上清3. 振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150l的溶液I （50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl(PH8.0), 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4），剧烈振荡5分钟打

12、散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。4. 加入300l溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合均匀，处理2分钟后加入225l溶液III（5mol/L乙酸钾 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。5. 加120l酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。6. 用120ul氯仿重复操作5。7. 加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。8. 沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50烘干后

13、加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20保存。氯化锂抽提法1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III处理）2. 加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。去上清，尽量去干净。3. 用少量70乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50烘干沉淀，用适量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。4. 12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心8min，去上清。5. 将沉淀用70%乙醇洗涤两次,

14、每次10min。50烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20保存。酶连反应一般采用10l反应体系：T4连接酶 1l ，连接酶缓冲液1l ，外源片段与载体按DNA 摩尔含量3:1加入即可。如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。外源片段与载体按DNA 摩尔含量为3:1或外源更多。DNA片段凝胶回收1试剂盒回收 (离心法)（详见说明书）(1) 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体

15、积(如1oomg=1ooul)(2) 根据凝胶的浓度,加DE-A 液凝胶浓度 DE-A溶液体积1.0% 3个凝胶体积1.5% 4 个凝胶体积2.0% 5 个凝胶体积混匀后于75oC加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45oC加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟).(3) 加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA片段小与400bp 时,加入异丙醇至终浓度为20%;(4) 吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;(5) 将制备管置回离心管,加0.5ml W1溶液,3600rp

16、m离心30,弃滤液;(6) 将制备管置回离心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次; （W2中含有酒精，应保证瓶子密封。）(7) 将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;(8) 将制备管置洁净的1.5 ml 离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.注意事项;1. 此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下.2. 勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.3. 2步骤中的

17、凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.4. 步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热到60C,可提高回收效率。（重要）5. DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。（试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。）2 silica回收1 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶, 用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;2. 加入2-3倍体积的6M KI或NaI（避光4度保存）;1. 65 oC温浴, 间断混合,直到凝胶熔化;2. 加适量的振匀的silica悬液（10ul）充分混匀, 冰上放置15分钟（或更长）,间断混合;3. 500

18、0rpm离心3分钟, 弃上清;4. 加1ml预冷的NEW buffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混匀），冰上 洗盐2 分钟，间断混合;5. 12000 rpm离心10s, 弃上清;6. 重复6,7步骤1次;7. 于50 oC烘箱烘干;8. 加10ul的去离子水用枪头打匀,65 oC水浴15分钟,间断混匀;9. 12000 rpm离心10 s，把上清转移到另外洁净的离心管中;10. 跑胶检测回收效率.注意事项 4-8步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低温下对DNA有吸附作用。 NEW Buffer：（100ml）1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This

19、-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去离子水加至100ml。（-20度保存） Silica配法见：TIG January 1995 Vol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.DNA纯化用苯酚:氯仿抽提1. 把样品至置于离心管中,加入等体积的苯酚:氯仿,2. 混匀,使之成为乳浊状;3. 12000rpm离心, 5 分钟:4. 用枪头把水相移到另一离心管中.5. 加入等体积氯仿并重复246. 用2/3体积的异丙醇（或2倍无水乙醇）,1/10体积的3

20、M醋酸钠,沉淀10分钟（-20度长时间沉淀可提高产量）7. 12000rpm离心5分钟,弃液体8. 70%的乙醇洗盐10分钟，去上清，9. 重复8一次，再12000rpm离心弃液体.10. 50度烘干.11. 去离子水溶解。LiCl 抽提1把样品至置于离心管中,加4/5体积10M LiCl2 室温下静置1分钟3 12000rpm离心5分钟4把液体转移到另一离心管中5.加2/3体积的异丙醇沉淀10分钟往下的步骤同于上面的8-12E.coil总DNA的提取 1 将过夜培养的大肠杆菌离心去上清。 2 加500l水重悬浮，加入500l 2% SDS, 混合振荡约1min，55温育15min，直到溶液的

21、粘度显著下降。 3 加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠（自然pH）。 4 加入150l中性苯酚，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。 5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止， 6 加入1倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA 沉淀团，用吸头挑出DNA沉淀团。 7 用70%乙醇洗涤DNA沉淀团两次。 8 烘干，溶解DNA沉淀。链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） 1 将适量的菌体悬浮于500l溶菌酶溶液（2）中，37温育1hr 左右至完全溶菌， 2 加入500l碱性SDS溶液（0.3mol/L N

22、aOH, 2%SDS），立即振荡混合完全， 3 打开管盖，在70放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55, 30min），然后于水浴中冷却至室温， 4 加入100l酸性苯酚/氯仿溶液，用混合器振荡至液体彻底混合均匀，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。 5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止。 6 在上清液中加入1/10体积的3M NaAc溶液和1倍体积的异丙醇沉淀5分钟（或2.2倍体积的无水乙醇沉淀1h），12000rpm离心8min， 7用70%乙醇洗涤沉淀两次, 8干燥后加一定量的TE（d2H2O）缓冲液溶解。另：可使用抽提总DNA的

23、试剂盒，将总DNA与质粒DNA一起抽提。去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） 注：CIAP一般为原酶，酶量过大会失去粘性末端，因此应适当减小酶的用量，一般0.5 ul即可。也可减少温浴时间，如37,1020min即可。 AT克隆（详见说明书）所用的载体:pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor System1. 酶连(1) 体系 10ul standard Reation Positive control Background control 2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligation 5ul 5ul 5ul

24、pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor(50ng) 1ul 1ul 1ulPCR product Xul - -Control insert DNA - 2ul -T4 DNA Ligase(3 weiss untis/ul) 1ul Deionized water to a final volume of 10ul 10ul 10ul(2).反应 4oC过夜注 :PCR产物和载体的摩尔比为:(ng of vector x kb size of insert)/(kb size of vector)*(insert: vector ration)=ng of insert 一般外

25、源和载体的摩尔比例为3:1T载体大小为 3bkb 50ng2. 转化(1) 取大肠杆菌感受态细胞100ul, 连接产物2-5 ul 加入1.5ml的离心管中,混匀.冰上放置20分钟.(2) 42oC热激90秒.(不要摇动)(3) 立即置冰上3-5分钟.(4) 加1ml SOC培养基(室温)(5) 37oC培养1.5小时(约150rpm摇动).(6) 离心,去上清,余下的混匀涂皿(LB/抗生素/IPTG/X-Gal).(7) 37oC培养1624小时,挑白斑. 所用的培养基:SOC培养基胰蛋白胨 2g酵母抽提物 0.5g1M NaCl 1ml1M KCl 0.25ml2M Mg2+储液 1ml2

26、M 葡萄糖 1ml* Mg2+储液 MgCl.6H2 O 20.33 gMgSO4.7 H2 O 24.65g加双蒸水到100ml,过滤灭菌* 葡萄糖过滤灭菌Southern Blot转膜1. DNA经酶切后，用Agarose凝胶电泳分离，切去多余的胶块并在右下角切去一角以便于识别方向，接着EB染色并拍照。（注意：TAE需新配，凝胶浓度视片段大小而定，一般为0.8%1.0%，电压150v/cm）2. 拍照后的凝胶先用无菌的去离子水轻轻摇晃，洗2次，5min/次。3. 去嘌呤：在室温下，把凝胶置于盛有0.25M HCl的大平皿中轻轻摇动，直到溴酚蓝由蓝变黄（如果杂交的目标片段小于5kb，此步可省

27、略），再用无菌水摇动洗5min 。4. DNA变性：把凝胶放入盛有变性液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次，再用无菌水洗5min。5. 中和：把凝胶放入盛有中和缓冲液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次。6. 把凝胶放入盛有20x SSC的平皿中，平衡10min。7. 印迹：用一玻璃板横放于盛有20x SSC的搪瓷盘上作为桥，把一张用20x SSC浸润的3MM 的Whatman滤纸铺在玻璃板上，其两端放入瓷盘的20x SSC液体中，用玻璃棒赶尽气泡。把凝胶（点样孔面朝下）放在滤纸上，避免气泡产生，凝胶周围用胶板封住。剪一张比凝胶略大的带正电的尼龙膜平铺在凝胶上，避免气泡产生，（使

28、凝胶湿润再放膜）。再在尼龙膜上放两张与尼龙膜大小一致的3MM滤纸，然后放一叠吸水纸在滤纸上，再在吸水纸上一平板，平板上放一500g的重物，印迹时间大于2h。8. 紫外交联：取下重物及吸水纸拿出尼龙膜放在一滤纸上，与胶接触面朝上，放入紫外胶膜仪中胶联。9. 用无菌水洗膜10min，如不立即杂交，自然烘干保存。预杂交及杂交1. 裁剪一张比尼龙膜稍大的杂交袋，把尼龙膜放入袋中，用封口机先封住三边，放入10ml预杂交液，赶尽气泡，封口。把杂交袋放入杂交筒中，预杂交时间大于4h,温度65C 。 2. 加探针：把探针先煮沸15min后立即放入冰中，至少10min ，然后把探针加入1ml预杂交液中，剪去杂交

29、袋一角，除去绝大部分预杂交液，加入杂交液，除尽气泡封口，放入杂交筒中65C 杂交620h。洗膜1. 用2 x SSC, 0.1%SDS室温下轻轻摇动洗2 次，5min/次2. 用0.5 x SSC, 0.1%SDS在 68C条件下洗膜 2 次，5min/次，轻轻摇动（可在杂交筒中进行）Dig检测1. 洗膜后，用washing buffer 摇动润洗 5min。2. 用100ml Blocking solution 温育30min，轻轻摇动。3. 用20ml Antibody solution 温育30min，轻轻摇动。4. 用washing buffer 轻轻摇动洗2 次，每次15min。5.

30、 在20ml Detection buffer 中平衡 5min。6. 把膜转到用铂纸包裹的盛有新配置的Colorsubtrate solution的平皿中显色。7. 用PH 8.0 TE终止反应。第三章 PCR及相关技术PCR不同公司不同的酶要求的反应体系与反应条件会有不同，PCR反应可参考该酶的产品说明上的反应体系与反应条件。一般的反应体系如：引物(50pmol/l)各1l 反应终浓度:各1pmol/l模板(约30ng/l)1l约30ngBuffer(10´, 含Mg2+)5l1´dNTPs(10mM)1l0.2M高温聚合酶(5U/l)0.21l15UddH2O总体积5

31、0lPCR反应参考程序：时间Step 1 预变性 95-96 3-8min Step2 变性 94 50secStep3 复性 50secStep4 延伸 72 Step5 2、3、4步骤循环（25次左右）；Step6 延伸 72 10 min4结束反应（4度长时间保温对PCR仪有较大损伤，一般不超过1小时便及时取出，绝对不允许过夜保温）。注：  引物应该用专门的软件（如Primer Premier）认真设计，注意两条引物的Tm值大致相等，GC含量较均一，引物自身以及之间不形成强的二级结构，特别是引物的3 端，引物不和模板其他位置形成强的配对（主要看引物3端）。  MgCl

32、2浓度依不同的模板和引物而定。MgCl2的浓度对PCR结果影响很大。  链霉菌的PCR因模板的GC含量高，可加DMSO（能降低复性温度）其浓度可在010%之间变化。  模板为环形质粒时若一次没有扩增出来，可以考虑先用酶将其切成线性再作。  对高GC含量的模板，预变性的时间也可适当延长，甚至先在沸水中煮5分种，然后迅速放入冰中。如果使用预变性温度高或时间长，一般要使用“热启动”，即在预变性后再加入酶，这样一是可以保护酶，二是可以避免低温时酶的非特异性扩增。  现在的PCR仪一般都有“热盖”装置，可以代替原来使用的矿物油，避免PCR过程中水份蒸发到管盖上。&

33、#160; 复性温度依引物Tm值及引物与模板的匹配程度而定，提高复性温度可提高扩增的特异性，而当无扩增条带时，可适当降低复性温度。  延伸时间可根据扩增区域的长度确定，扩增区域越长，延伸时间越长。不同的聚合酶的延伸速度不一样，具体看说明书，一般高保真聚合酶平均每分钟延伸600bp，普通Taq酶每分钟延伸1kb。  根据不同需要使用不同的聚合酶，尤其当用于扩增表达的基因序列时，一定要使用高保真的酶，作普通的PCR验证时就可用普通Taq酶。以链霉菌或其他高GC含量的DNA作模板时，由于GC含量越高，模板和引物的二级结构越复杂，延伸和配对越难，PCR反应不好做，可以暂时（2003

34、年7月）用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR，保真度不敢保证，但扩增效果很好。酶的用量可参考说明书，并不是越多越好。  LA Taq酶的GC buffer往往能用于别的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest)，使它们也能很容易地扩出高G+C的模板来。PCR重组（详见PCR技术实验指南p429 重叠延伸技术）注：1. 两条模板的量无需太大，因尽量保证1:1。 2. 保证引物之间不会有干扰 3. 四条引物的PCR重组比三条引物的 PCR桥重组容易操作。即分别设计引物对两个模板进行扩增，使扩增后两个模板有35-40bp的重叠序列，分别回收两个模板在只有两条外引物的条件下进行常规

35、PCR.PCR定点诱变（DpnI法）1. 引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长2545bp，设计的突变位点需位于引物中部。2. PCR反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ；循环次数少，一般为12个循环。 反应体系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul 模板DNA(550ng) 1ulprimer 1 (125ng) 1ulprimer 2 (125ng) 1ulpyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul加无菌蒸馏水至 50ul 3. PCR产物沉淀纯化：加1/

36、10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20C冰箱）5min，离心弃上清，7075%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）4. DpnI酶切： Buffer 2ul BSA（100） 0.2ul DNA x ul DpnI 0.5ul 加无菌去离子水至 20ul 30C酶切 14 h ；65C 水浴15min 终止反应。5. 将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。6. 测序验证第四章 基因片段转移技术大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化1. 挑取保存的感受态细胞在LA平板上划单菌落。2. 挑取长好的单菌落接入到装有5m

37、l LB的universal瓶中，摇床过夜培养。3. 从universal中取1ml过夜培养物，转接于装有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受态效率）的250ml三角瓶中，培养2.53小时至OD6000.64. 将培养物倒入50ml已预冷的大离心管中，置于冰上待冷却5. 离心，4.5000rpm.3分钟6. 倒去上清液，先加少量0.1M CaCl2 ，打散沉淀，再加10ml，混匀，于冰上放置至少30分或过夜。7. 离心，4.5000rpm.3分钟8. 弃上清，加1ml 0.1M CaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，即可使用。以上步骤均需注意无菌和低温操作。DNA转化1. 取100l感受态细胞

38、和5l的酶连产物或1-2ul质粒混合2. 冰上静置30分钟3. 42热激90秒，然后在冰上放置5min4. 加0.75ml LB培养基，在37度摇床上培养45分钟。然后3600转离心2分钟，去掉大部分上清。（此步不作为快转，作为慢转，慢转可提高效率，有些抗生素如Kan筛选时用慢转较好）5. 涂布于有抗生素的筛选平板，一般12小时可有转化子出现。大肠杆菌质粒的快速检测1. 从转化子平板上挑取单菌落，在另一平板上划小方块，37扩大培养12小时2. 刮取适量（偏少）的菌体悬浮于30l快检液I溶液中振荡均匀3. 加入15l碱性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS）（天冷时先使该溶液预热

39、），立即振荡混合完全。4. 在70放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55, 30min）水浴时间不宜过长。5. 冷却至室温，直接上样跑琼脂糖凝胶电泳检测（如果菌体过多，则点样时会发现样品很粘，所以掌握不好时可以在第4步之后加上一部5ul苯酚抽提，离心的步骤。） 如果没有用苯酚处理，看胶时会发现很明显的总DNA的条带，但不影响实验结果的观察。 点样时注意点上质粒载体质粒对照，一般在快检时会出现质粒CCC构型的条带，有时也会出现OC构型的。 快检液I：0.3M蔗糖，25mM pH8.0 Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.02溴甲酚绿接合转移（详见英文手册249页）1.带有or

40、iT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567( pUZ8002),得到转化子;2. 将转化子的过夜培养物转接在LB中，在合适抗生素下,37 oC培养转化子,到合适浓度(OD600:0.4-0.6)收集菌体;3. 用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素), 0.1倍体积的LB悬浮.备用;4. 链霉菌孢子的热激和预萌发（一般的接合转移只须做热激） (1)新鲜孢子悬浮于5ml 0.05M PH8.0 的TES; (2)50ºC水浴热激10分钟; (3)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基; (4)37ºC摇床分别培养2-小时; （5）离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或T

41、ES中; （6）在振荡器上打散孢子或只作热激按下面步骤：将适量的孢子加入1ml SOC或2倍YT培养基，50度处理10分钟，离心，去大部分上清。5. 按(1*e-8)：(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀(不一定)6. 30ºC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大肠杆菌）覆盖6. 30ºC培养数天（一般2天）可得到接合转移子.7. 挑选接合转移子到含适当抗生素和萘啶酮酸的平板上, 验证;（作筛选双交换菌株时继续作下面步骤）8. 直接将得到的接合转移子作影印，寻找单抗的菌株即为双交换菌株。如果得不到，就要通过单交换菌株的松弛培养来得到双交换菌株。得到的单交

42、换接合转移子划线于合适的培养基(含萘啶酮酸，不含别的抗生素)松弛培养;9. 得到的孢子或菌体稀释涂皿或划单菌落（for Bld菌株）, 影印筛选双交换.注意事项:1 不同的孢子热激的温度和时间不同,预培养的时间不同.2 不同的链霉菌接合转移所用的培养基不同预萌发培养基Difco 酵母膏 1% Difco 酪蛋白氨基酸 1% CaCl2 0.1M(需配制5M的原液,分开灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)链霉菌原生质体的制备 1. 在装有不锈钢弹簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1)(一定要加Glycine)，接种100ul的孢子悬液，于30度摇床中培养3640 hr（视具

43、体情况，有时培养24h已足够。）。2. 将培养物倒入universal中，用无菌水涮洗三角瓶，收集洗液于同一universal中，然后3000 rpm离心10 min。3. 弃上清，将菌丝体悬浮于15 ml的10.3%的蔗糖溶液中，3000 rpm离心10 min，弃上清。同此法洗两次。4. 取1 ml菌丝体，加入4 ml的溶菌酶溶液（溶菌酶母液为50mg/ml P Buffer，终浓度为2 mg/ml，用P Buffer稀释），于30度水浴3060 min（间隔七八分种轻轻摇动）至上清呈乳状。5. 加入5 ml的P Buffer并用5 ml的吸管吹吸几次，继续温浴10 min。（使大量的原生

44、质体释放出来。）6. 用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的universal中，3000 rpm离心7 min（不用brake档防止其破裂）。原生质体沉淀呈黄色。7. 弃上清 ，轻柔打散原生质体，用P Buffer洗两次（洗去溶菌酶）。每次仍使用3000 rpm离心7 min。（此步可省略）8. 弃上清，用枪将原生质体打散，分装，于-70度保存。注：1. P缓冲液（原生质体转化用）（Okanishi, 1974） 蔗糖103g，K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, 微量元素溶液 2ml，蒸馏水 800ml 灭菌后每80ml上述溶液中加入：0.5% KH2

45、PO4 1ml, 3.68% CaCl2·2H2O 10ml, 5.73% TES 缓冲液(pH7.2) 10ml 2溶菌时间不能过长，否则会使原生质体破裂。离心后若看到很粘的絮状物，则说明原生质体破裂。链霉菌原生质体的转化 1. 将最多5 ul的DNA（质粒或酶连产物）加于已经装有50 ul原生质体的指型管（1.5 ml）的管壁上（不与原生质体接触）。2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG应先灭菌，再用P Buffer配置），将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次使之混匀。3. 将混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。4. 30度培养1420 hr后（待原生质体再生

46、后，即平板呈雾状），用含有适当抗生素的1 ml无菌水溶液覆盖。5. 再培养12 d后，可以看到小的转化子菌落长出。PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化1. 将天蓝色链霉菌库斯质粒转化进入大肠杆菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常规的CaCl2 法。（pIJ790带有cat基因和对温度敏感的复制区，培养时温度要严格控制在30C以下）2. 培养含库斯质粒的BW25113/pIJ790菌株：从平板上挑取大肠杆菌单菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM

47、）中，30C摇床培养过夜。3. 取一部分过夜培养物至25ml新鲜的SOB-MgSO4 培养基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌体终浓度为1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖诱导/red 重组系统。4. 30C ，200rpm摇床培养3-5h 至OD6000.6 。5. 将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在04C)。4000rpm 4C离心 5min。6. 弃掉上清，加1ml预冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,摇匀。7. 4000rpm 4C离心 5min，弃掉上清，用10%甘油洗涤。重复上面操作：4000rpm 4C离心5min，尽量弃去上清，用残留液将细胞打散。（感受态细胞浓度越高电转效果越好）8. 在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50ul感受态细胞与1-2ul PCR产物（经纯化，可尽量浓，但不能加得过多），混匀后立即电击，电击条件：200,25uF,2.5kv, 电击结果为4.54.9ms 较理想。（电转化杯在70乙醇中保存，用前先在无菌环境下用无水乙醇洗一下，再吹干，放冰上预冷，无水乙醇能加快吹干的速度。也可以选择0.1cm的电转化杯，但电击的参数就得变为：1.8 kV，？,?uF）9. 立即加1ml预冷的SOC，37C诱导培养40min（如需在同一库斯质粒上中断基因，