分子生物学实验课程论文

1、分子生物学实验课程论文 学生姓名： . 学 号： 班 级： G20本 专 业： 生物技术（生物制药） 学 部： 生物医药 二一一年十二月 基因工程技术的操作-分、切、接、转、筛摘 要基因工程即重组DNA技术，是指对不同生物的遗传基因，根据人们的意愿，进行基因的切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型。世界上第一批重组DNA分子诞生于1972年，次年几种不同来源的DNA分子装入载体后被转入到大肠杆菌中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。基因工程彻底改变了传统生物科技的被动状态，使得人们可以克服物种间的遗传障碍，定向培养或创造出自然界所没有

2、的新的生命形态，以满足人类社会的需要。关键词：基因工程、基因的切割、拼接、重新组合、筛目 录1引言. . 32仪器、材料与法.32.1仪器. . .32.2材料. . 32.2方法. .33结果与分析. .64讨论. . 85结论. 96对课程及老师的意见和建议参考文献. 9致谢. . . 9 1 引言 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得

3、目的基因的方法也比较简单。 DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5-磷酸和3-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成14核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶

4、切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合

5、成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5磷酸基团或3羟基与另一个平末端的3羟基和5磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平末端的连接速度为粘性末端的1/101/100。为了提高其反应活性，一般选择16较为合适。 外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到真核细胞，进一步

6、到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。 所谓受体细胞（receptor cell）又称为宿主细胞或寄主细胞（host cell）等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般情况下，受体细胞的选择应符合以下基本原则： （1）便于重组DNA分子的导入；（2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；（3）便于重组体的筛选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；（5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；

7、（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达；（7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞选择的总原则，在实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分要求即可。 原核生物细胞: 是较为理想的受体细胞类型，其原因是：（1）大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA进入；（2）没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦；（3）基

8、因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；（4）原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主菌。至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌等。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。 体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径

9、，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。本实验以大肠杆菌为受体的基因转移。 转化方法：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。 以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤： （1）细菌感受态的形成；（2）转化因子的吸收；（3）整合复合物前体的形成；（4）单链DNA转化因子的整合；（5）转化子的形成。 大肠杆菌是一种革兰

10、氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA分子更是如此。因此在大肠杆菌的重组质粒DNA分子的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表方法之一是Ca2诱导的大肠杆菌转化法。 Ca2诱导的转化：细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。其原理是将处于对数生长期的细菌置于

11、0，CaCL2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2 又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。 Ca2处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得105106个转化子，环化重组子分子愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高1000倍。 转化子的筛选以及鉴定：在重组

12、DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此，如何将被 转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来，然后进一步检测到含有期待重组 DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和表达的效果，也是基因克隆和工程操作中极为重要的环节。 通常我们将导入外源D

13、NA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子，而含有重组DNA分子的转化子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。 在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。 选择培养基是根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择

14、物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定，一般与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显色剂等，相应的筛选（选择）方法包括抗药性筛选、插入失活筛选和显色互补筛选等。 在本实验中利用的是麦康凯培养基，用来筛选重组子。质粒PUC19进入E.coliDH5后，通过-互补作用，形成完整的-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基的平板上，转化子利用-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，PH降低培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红色。而含有外源基因片段的PUC质粒进入受体细胞后，不能形成互补的-半乳糖苷酶活性而出现白色菌落，这样根据这个条件即可筛选重组子。2 仪器、材料与方法2.1 仪器UC19的质粒

15、、LB培养基、提取质粒试剂盒 ,恒温振荡培养箱，高速离心机，旋涡振荡器，水浴锅，酒精灯，微波炉，天平，电子天平，分析天平，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，塑料薄膜，微量移液器，手套，记号笔2.2 材料LB培养基，抗生素氨苄青霉素(50ug/L)，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，50×TAE缓冲液，溴化乙锭(EB)， DNA相对分子质量标准物DNA Marker kHind2.3 方法2.3.1实验阶段 2.1 酶切2.1.1 Puc19的质粒DNA酶切体系：8.7 uldd H2O 、4 ul PUC19质粒DNA、

16、1.5 ul 10×Buffer 、0.8 ul Hind。2.1.2 按上述的顺序将酶切体系加好，混匀，置于37的水浴锅内2h。 2.2PCR扩增目的基因2.2.1 取2个PCR专用管，其中一个管添加以下各种成分反应液，另外一个管少加其中一种成分ddH2O 83.8 µl模板DNA (自提pBSKPVYCP450)1 µl（20ng）上游引物(10µmol/L) 1 µl下游引物(10µmol/L) 1 µldNTP mixture(10mmol/L) 2 µl（各2.5mM）10×缓冲液+ MgCl2

17、 10 µlTaq酶 1.2µl （1.25 U）总体积 100µl；2.2.2 将以上各成分混匀，稍作离心，将反应管放入PCR仪中2.2.3 设定反应程序： 94条件下使模板DNA预变性2min。 变性94 0.5min 退火60 0.5min 30 cycles 延伸72 0.5 min最后在72条件进行延伸2min2.2.4、反应结束后，置于-20 冰箱保存 2.3 连接2.3.1 连接体系：9 ul的dd H2O、3ul的digested PUC19DNA、5ul的digested噬菌体的DNA、2ul的10×Buffer、1ul的T4连接酶。2

18、.3.2 按照上述顺序依次加入，混匀，16的水浴锅，连接过夜。 2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化2.4.1 制备感受态细胞（无菌条件）2.4.1.1 取6ml LB液体培养基于试管中，加200µl E coli DH5a菌液，放入37摇床中振荡培养23小时（培养液开始出现混浊，用分光光度计测600nm光吸收值，A600nm0.7）。将事先已经培养好的OD值为0.5左右的大肠杆菌的菌悬液置于冰上，备用；2.4.1.2 无菌条件下用灭菌的镊子取出一个灭菌的Eppendorf管，每管加菌液1.5ml，离心6000 rpm 2分钟，弃上清2.4.1.3管中加600µl

19、冰冷的0.1 mol/L CaCl2 ，悬浮菌液，置于冰上5分钟，离心4000 rpm 10分钟，弃去上清液。）2.4.1.4 每管加入300µl冰冷的0.1 mol/L CaCl2 ，悬浮菌液，置于冰上待用（至少20分钟）。2.4.2转化2.4.2.1 取四个灭菌的0.5ml的Eppendorf管，标记好后分别加入： 1号：100µl感受态细胞+2 µl同学提取 pUC19 （受体菌对照组1） 2号：100µl感受态细胞+4µl连1（转化实验组） 3号：100µl感受态细胞+4µl连2（转化实验组） 4号：100µ

20、;l感受态细胞+2µl无菌水 （受体菌对照组2）2.4.2.2混匀,冰浴30分钟，42水浴中保温90秒，迅速，在冰上冷却35分钟，上述各管中分别加入100µl LB液体培养基，总体积约为200µl（此时溶液称为转化反应原液。摇匀后置37振荡培养（温浴）1530分钟。 2.5 涂布2.5.1 在4个管中各加入4µl IPTG、20 µl X-Gal、混匀，各取100 µl培养液涂板2.5.2 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养12-16小时，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养 2.7 涂布观察2.7.1 观察

21、平板上菌落的生长情况： 2.8 验证2.8.1 用接种环挑取平板上单独的大的白色菌落在液体培养基中（菌落的选择一定要适当，这对于后面的验证很重要）；2.8.2 挑取两管菌液，做好标记，37振荡培养过夜；2.8.3 用试剂盒提取质粒：2.8.3.1 在两个EP管中各加1.5ml的菌液，10000rmp×1min，之后倒去上清， 在各加1.5ml菌液离心（两管菌液不要混用，可以看做两种质粒）；2.8.3.2 吸取上清后，加入250微升的溶液，充分振荡混匀，使细胞悬浮；2.8.3.3 加入25微升溶液，请求那个翻转倒置数次，直到获得透明的裂解液；2.8.3.4 加入350微升的溶液，立即翻

22、转倒置数次至有絮状沉生成；2.8.3.5 之后离心，10000rmp×10min，吸取上清于离心柱中，离心10000rmp×1min，弃收集管中的液体；2.8.3.6 在离心柱中加500微升的BufferHB，离心10000rmp×1min，弃收集管中的收集液；2.8.3.7 在离心柱中加入700微升的Wash Buffer，离心10000rmp×1min，弃收集管中的收集液；2.8.3.8 空离心柱再离心13000rmp×2min；2.8.3.9 将离心柱取出置于1.5ml的EP管中，加入40微升的Elution Buffer,将液体加在离心

23、柱的孔中，静置2min,之后离心13000rmp×1min;2.8.3.10 将离心柱取出，将EP管中的质粒DNA放好，做好标记；2.8.4 重组质粒DNA 的酶切2.8.4.1 重组质粒DNA的酶切体系：4.5 ul的dd H2O，4ul的重组质粒DNA，1.0ul的Buffer，0.5ul的Hind；2.8.4.2 按照上述的顺序，一次加入，混合均匀，置于37的水浴锅内1h;2.8.5 电泳2.8.5.1 在所得的酶切液中加入3微升的Loating Buffer,混合均匀点在胶孔中，点上相应的Hind的marker；2.8.5.2 在EB中染色10min左右在紫外灯下观看实验现象

24、，分析条带3 结果与分析3.1琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物下面为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图： 1 2 3 4 5 6 7 8 9如左图所示为本人PCR扩增产物电泳结果。Line1:含DNA样品3µl的PCR扩增产物Line2:含DNA样品8µl的PCR扩增产物Line3：DNA Marker（ DL2000）Line4: 含DNA样品3µl缺少上游引物的PCR扩增产物Line5：含DNA样品:8µl缺少上游引物的PCR扩增产物Line6：同组同学做的含DNA样品3µl的PCR扩增产物Line7：同组同学做的含DNA样品8µl的

25、PCR扩增产物图表 1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳 Line8：缺少DNA模板的PCR扩增产物 Line9：缺少DNA模板的PCR扩增产物分析：Line1、2在450bp处出现条带说明PCR扩增目的基因成功。Line2亮于且宽于Line1说明电泳时上样量越多，条带越亮越宽。Line4、5没有出现条带，说明PCR扩增基因过程中，反应体系缺少任何一种都不会扩增成功。Line2明显亮于宽于Line1原因，说明上样量越多，条带越亮。3.2载体DNA和目的基因的酶切及电泳检测下面为载体DNA和目的基因酶切的琼脂糖凝胶电泳图 1 2 3 4 5 6 7 8 9如左图所示：Line1：自提的载体pUC19酶

26、切Line2：不加内切酶的对照样品电泳Line3：PCR扩增产物酶切电泳Line4：同组同学做的pUC19酶切电泳Line5：同组同学做的对照样品电泳Line6:同组同学做的PCR扩增产物酶切电泳Line7：DNA Marker（ DL2000）Line8：DNA Marker（DNA- Hind ）图表 2载体DNA和目的基因酶切的琼脂糖凝胶电泳图分析：Line1在约2690bp处有条带， 说明酶切载体DNA（pUC19）成功。因为理论上酶切pUC19 KpnI酶切位点在408，BamHI酶切位点在417，所以酶切后电泳应出现2条带，一条9bp另一条2690bp，又因为9bp在电泳图中显示不出来，所以应只有1条带约2690bp。Line2出现一条带。2号样品作为1号的对照，不加入内切酶，所以电泳结果理论上应有3条带，分别是CCCDNA、OCDNA和LDNA.CCCDNA的电泳速度大于LDN