生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究

1、桂林理工大学生物工程专业技能实习报告生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究学生姓名： 指导教师： 摘要：生姜蛋白酶是一种有待开发利用的新的植物蛋白酶。本实验对生姜蛋白酶的提取方法和纯化工艺进行了研究。实验中使用以乙醇或丙酮为溶剂的有机溶剂沉淀法和硫酸铵盐析法提取生姜蛋白酶，测定各方法提取物的蛋白含量和酶活性，确定最佳的提取方法。再通过双水相萃取和反胶束萃取两种方法纯化粗酶。双水相萃取是用PEG4000/硫酸铵、PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4两种双水相体系，反胶束萃取是用AOT/异辛烷、CTAB/正辛醇两种反胶束体系。关键词：生姜蛋白酶；有机溶剂沉淀法；硫酸铵盐析法；双水相萃取；反胶束萃取

2、Research on extraction and purification of Ginger proteaseStudent: GUO Bo-hua Teacher: LI Hai-yun, LI Zi-yuan, LIU Hong-yanAbstract: Ginger protease is a pending development and utilization of new plant protease. The experiments on Extraction of ginger protease and purification process were investig

3、ated. With ethanol or acetone as extraction of ginger protease organic solvent precipitation and ammonium sulfate salting out method used in the experiment, protein and enzyme activity of the extracts, the optimum extraction method. The purification of crude enzyme of aqueous two-phase extraction an

4、d reverse micelles extraction two methods. Aqueous two-phase extraction with PEG4000/ ammonium sulfate, PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4 two aqueous two-phase system, reversed micellar extraction is used AOT/ isooctane, CTAB/ octanol two reverse micellar system.Key words: Ginger protease; organic solvent ext

5、raction; ammonium sulfate salting-out; aqueous two-phase extraction; anti-micelle extraction前 言生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶在肉类嫩化、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发潜力较大。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味。生姜蛋白酶用于酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度1。1968 年，MiChi 等

6、人首先报道了生姜蛋白酶。1973 年，Thompson等人从生姜根茎中提取了生姜蛋白酶，并命名为 Zingibain，并指出它具有较高的最适温度(60 )等特性，因此有较好的应用前景。同年，Ickikawa 和 Roshie 等人用 DEAE纤维素柱层析对该酶进行了纯化，证明该酶是由两个组分(GP1、GP2)构成的，除电泳迁移率外，两个组分在其他方面基本相同；用 Sephadex G100 测得两个组分的分子量均为 22500，该酶结晶为六面体。1978 年，Ohtsuki、kozo 等人用 P100 生物胶过滤对该酶进行纯化，得出该酶分子量为 29000。1995年，Ohtsuki发表论文，

7、报道了用 DEAESepharose和 Sephadex G75 纯化生姜蛋白酶之后，用等电聚焦电泳可将该酶分为三个组分，并用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和 TSKG2000SW 凝胶过滤再次证明该酶分子量为 29000。同年，赵帜平等以安徽舒城的生姜为原料，采用 DEAE纤维素 DE52 和 SephadexG75 纯化得两个组分，用苯酚硫酸法鉴定均为糖蛋白，并证明糖肽键型均为非 O 型。1999 年，kyung等利用 X射线晶体衍射法研究了生姜蛋白酶 2.1A 精确度下的晶体结构。发表了以下重要研究成果：（1）生姜蛋白酶是一个含有 221 个氨基酸残基的糖蛋白，在 Asn99 和 Asn15

8、6 上有两条 N 型寡糖链，糖基含量占 8，并阐明了寡糖残基的组成及连接方式。（2）生姜蛋白酶总体结构类似于生姜蛋白酶等其他植物巯基蛋白酶，肽链折叠成两个独立的大小差不多的结构域，两者之间有一道裂隙，活性中心就位于裂隙中。（3）DTT 对该酶有强烈的激活作用。（4）结晶为四聚体，阐明了单体间的连接方式。2002 年，代景泉以莱芜生姜为原料，用硫酸铵沉淀法对生姜蛋白酶进行粗提，证明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性质，并用DEAE纤维素DE52 对该酶进行纯化，将该酶分为两个组分2。生姜蛋白酶目前广泛采用的提取方法主要有沉淀法和超滤法两大类，通常采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，

9、以及单宁等。沉淀法大都以丙酮粉作为酶的来源，沉淀剂对酶及蛋白质进行沉淀，从而将生姜蛋白酶从大量的杂质中分离出来，制成丙酮粉后还可以在低温下长期保藏，其性质十分稳定；唐晓珍首先报道了采用超滤法提取生姜蛋白酶，基本工艺如下：生姜洗净切碎榨汁离心除去淀粉抽滤超滤取浓汁真空冷冻干燥保存。近几年的一些新的提取方法，则综合运用了上述各种方法，例如：2000年，Kyung在研究生姜蛋白酶的氨基酸序列时，采用如下的提取方法5：生姜切成小块，3下，在1000 mL 20 mM 7.0 的磷酸缓冲液中研磨，混合物搅拌 1 h 然后用纱布过滤，取滤液。滤渣再用500 mL缓冲液浸提，过滤，合并滤液，加入2的氯化钠，

10、搅拌 2 h，在4下15000g离心30 min。上清液用硅藻土过滤以除去悬浮物，然后加入硫酸铵至20饱和度，将溶液搅拌1 h，然后13000g离心30 min，上清液继续添加硫酸铵至60饱和度，用NaOH调节pH至7.2，4下搅拌3h，离心取沉淀，用约150mL 20 mM pH为7.0的磷酸缓冲液（含有5 mM的连四硫酸钠）溶解。溶液用截流分子量为12000的透析袋对20 mM pH为7.0的磷酸缓冲液（其中含有5 mM的连四硫酸钠，1mMEDTA）透析16 h以上。透析液在4下10000g离心30min以除去任何不溶性物质的粗酶液，并在此基础上进行层析纯化。又如：2005年，Adulya

11、tham等在研究生姜蛋白酶的部分纯化和稳定性的时候采用如下的提取方法6：鲜姜，切片，与4倍（w/v）的冷Tris-盐酸缓冲溶液（0.05M, pH8.0）混合均匀，均质，四层纱布过滤，滤液在5，12000g的离心机中离心20 min。上清液，即生姜蛋白酶，在5保存。生姜蛋白酶属大分子物质，在超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且存在生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及有机溶剂残留问题；盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强，制得的生姜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业上的放大生产，且用于亲和层析的前处理液是

12、需经过初步纯化的酶液。相对来说，双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶3。胶束萃取是适合生化分离的新技术，成本低，溶剂可重复利用，萃取率和反萃取率都很高，条件温和，有可能解决外源蛋白的降解问题，不引起蛋白质和酶的变性，操作简便，构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，可直接从整细胞中提取蛋白质和酶4。对于反胶束酶系统的研究，主要集中于反胶束中酶的定位和结构、酶催化的动力学特征、酶的催化活性及稳定性等方面。1 实验原理1.1 有机溶剂沉淀蛋白质原理与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不

13、同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。1.2 盐析法蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的

14、。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。1.3 双水相萃取原理双水相萃取是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相的浓度不同。对于蛋白质，只要选择合适的双水相体系，控制一定条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化的目的。1.4 反胶束萃取原理表面活性剂在溶液中形成反胶束

15、，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力，当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白的水溶液接触后，蛋白及其他亲水性的物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。2 实验部分2.1 材料、试剂与仪器2.1.2 实验原料新鲜生姜。2.1.3 主要试剂磷酸缓冲液（0.05mol/L,PH7.5）、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（0.05mol/L,PH6.0）、丙酮、聚乙二醇（40%PEG4000溶液）、40%硫酸铵溶液、20%PH6.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液、无水乙醇、AOT（0.05mol

16、/L）、异辛烷、正辛醇、CTAB（0.05mol/L）、0.1mol/L KCl溶液、0.2M KCl溶液、0.4M KCl溶液、0.1M NaCl溶液、0.2M NaCl溶液、0.4M NaCl溶液、40%PBS缓冲液、牛血清蛋白溶液（0.1mg/mL）、盐酸（0.2mol/L）、1%酪蛋白、三氯乙酸（0.4mol/L）、考马斯亮蓝 G-250 溶液。2.1.4 主要仪器紫外分光光度计、离心机、搅拌机、恒温水浴、移液管、天平、电子天平、冰箱、刻度试管。2.2 实验方法2.2.1 生姜蛋白酶的常规提取纯化工艺2.2.1.1生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切

17、成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4静置2h后，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）定容至100mL（生姜蛋白酶溶液A），4冰箱贮存待用。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.1.2乙醇沉淀法取生姜蛋白酶溶液A 20mL，加入1.5 倍的无水乙醇进行沉淀，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）

18、。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液B）。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.1.3丙酮沉淀法取生姜蛋白酶溶液A 20mL，加入1.5 倍的4预冷丙酮进行沉淀，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液C）。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.1.4盐析法取生姜蛋白酶溶液A 20mL，加入固体硫酸铵至 40%饱和度，4静置 3

19、0min后，离心（4000rpm，10 min），收集上清液继续加入硫酸铵至 60%的饱和度，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min），收集沉淀。0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液D）。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.2 生姜蛋白酶聚乙二醇/硫酸铵双水相萃取工艺2.2.2.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨（粉碎）匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量

20、磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入1.5 倍的4预冷丙酮进行沉淀，4静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至25mL。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.2.2 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系相图的绘制以PEG4000/硫酸铵体系为例进行相图的绘制。取40%PEG4000溶液（%）10 mL 于三角瓶中，用40%硫酸铵溶液（%）装入滴定管中滴定至三角瓶

21、中溶液恰好浑浊，记录硫酸铵消耗的体积。再用滴定管加入适量水，使体系澄清，计量加入的水，并继续用硫酸铵滴定至恰好浑浊，如此反复操作，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG和硫酸铵的浓度（%），并填入表1中。以硫酸铵的浓度（%）为横坐标，PEG浓度（%）为纵坐标，绘制出PEG4000-硫酸铵双水相体系相图。表1 PEG4000/硫酸铵双水相体系相图制作表（PEG4000= 4 g; 温度t=27）编号H2O累计添加量（mL）硫酸铵溶液读数（mL）三角瓶中纯硫酸铵累积量（g）溶液总体积（mL）PEG4000浓度（%）硫酸铵浓度（%）1042.70.6811.734.195.8120

22、.342.90.7614.627.405.2130.643.30.921625.00 5.75 40.843.40.9617.123.395.615143.71.0818.421.745.8761.244.21.2819.920.106.43 71.444.81.5221.618.60 7.0781.645.41.7623.117.327.62 91.845.71.8824.416.397.7010246.32.0425.815.507.91 2.2.2.3 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取生姜蛋白酶称取不同分子量的PEG(1000、2000、4000)溶解于水配置成40%浓度的系列溶液备用。硫

23、酸铵配制成40%溶液备用。按下表加入各物质，振荡均匀后静置2h待其分相，记录分相情况。若分相，分别读取上下相体积，并测定上下相中蛋白含量和蛋白酶活性。表2 PEG/硫酸铵双水相萃取生姜蛋白酶体系组成40%PEG溶液mL40%硫酸铵溶液mL粗酶液mL水mL总体积mL4.54.510104.5410.5104.53.5111044.510104410.51043.511103.54.510103.5410.5103.53.51110按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活）、蛋白分配系数Kp： 2.2.3 生姜蛋白酶聚乙二醇/磷酸盐双水相萃取工艺2.2.3.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机

24、械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨（粉碎）匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入1.5 倍的4预冷丙酮进行沉淀，4静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至25mL。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.3.2 聚乙二

25、醇/磷酸盐双水相体系相图的绘制以PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4（pH6.5）体系为例进行相图的绘制。取40%PEG4000溶液（%）10 mL 于三角瓶中，用20%pH6.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液（%）装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液恰好浑浊，记录NaH2PO4-Na2HPO4消耗的体积。再用滴定管加入适量水，使体系澄清，计量加入的水，并继续用NaH2PO4-Na2HPO4滴定至恰好浑浊，如此反复操作，记录每次NaH2PO4-Na2HPO4消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG和NaH2PO4-Na2HPO4的浓度（%），并填入表3中。以NaH2PO4-Na

26、2HPO4的浓度（%）为横坐标，PEG浓度（%）为纵坐标，绘制出PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4双水相体系相图。表3 PEG4000/ NaH2PO4-Na2HPO4双水相体系相图制作表（PEG4000= 4 g; 温度t= 27）编号H2O累计添加量（mL）硫酸铵溶液读数（mL）三角瓶中纯硫酸铵累积量（g）溶液总体积（mL）PEG4000浓度（%）硫酸铵浓度（%）104.60.2411.335.40 2.12 20.44.80.3211.833.90 2.71 30.74.90.3612.232.79 2.95 40.95.10.4412.532.00 3.5251.15.20

27、.4812.7531.37 3.7661.35.30.5251330.77 4.00 71.55.50.613.330.08 4.5181.75.650.6613.5529.52 4.8791.95.80.7213.828.995.22102.15.90.7614.0528.47 5.412.2.3.3 聚乙二醇/磷酸盐双水相体系萃取生姜蛋白酶40%聚乙二醇溶液：称取不同分子量的PEG(1000、2000、4000)溶解于水配置成40%浓度的系列溶液备用。40%PBS缓冲液：按一定比例配置pH系列（6.0、6.5、7.0）的PBS缓冲液。按表4加入各物质，振荡均匀后静置2h待其分相，记录分相情

28、况。若分相，分别读取上下相体积，并测定上下相中蛋白含量和蛋白酶活性。表4 PEG/NaH2PO4-Na2HPO4双水相萃取生姜蛋白酶40%PEG溶液mL40%PBS溶液mL粗酶液mL水mL总体积mL4.54.510104.5410.5104.53.5111044.510104410.51043.511103.54.510103.5410.5103.53.51110按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活）、蛋白分配系数Kp： 2.2.4 生姜蛋白酶AOT/异辛烷反胶束萃取工艺2.2.4.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入

29、磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨（粉碎）匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入1.5 倍的4预冷丙酮进行沉淀，4静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至25mL。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.4.2 AOT/异辛烷反胶束溶液的配制以异辛烷为溶剂配制浓度为0.05mol/L的

30、AOT溶液。按表5所示，向溶液中加入各试剂，混匀后3000r/min离心30min得澄清透明溶液即为反胶束溶液（底层有少量水不影响实验结果；若不澄清透明即不能形成反胶束溶液），计算体系含水量W0。（体系中含水量 Wo是指反胶束体系中水(缓冲溶液)与表面活性剂的物质的量之比, 即WoH2O/S总。）若形成反胶束溶液，则继续进行2.2.4.3步骤。表5 AOT/异辛烷反胶束体系萃取生姜蛋白酶编号AOT溶液体积mL0.1MKCl溶液体积mLW0是否形成反胶束1100.182100.273100.36分别以0.2M KCl、0.4M KCl、0.1M NaCl、0.2M NaCl、0.4M NaCl溶

31、液代替表中0.1M KCl溶液，同法操作。2.2.4.3 AOT/异辛烷反胶束萃取生姜蛋白酶移取10mL生姜蛋白酶提取液加入上述AOT/异辛烷反胶束体系中，搅拌萃取60min，静置分层后，测定上下相体积，并从下相中取样测定蛋白含量和蛋白酶活（上相中蛋白含量和酶活由总蛋白和总酶活减去下相而得）。按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活）、蛋白分配系数Kp： 2.2.5 生姜蛋白酶CTAB/正辛醇反胶束萃取工艺2.2.5.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比 1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨（粉碎）匀浆30

32、 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4静置 2 h，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液加入1.5 倍的4预冷丙酮进行沉淀，4静置过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至25mL。取样按2.2.6方法测定蛋白质含量，按2.2.7方法测定酶活。2.2.5.2 CTAB/正辛醇反胶束溶液的配制以正辛醇为溶剂配制浓度为0.05mol/L的CTAB溶液。按表6所示，向溶液中加入各试剂，混匀后3000r/mi

33、n离心30min得澄清透明溶液即为反胶束溶液（底层有少量水不影响实验结果；若不澄清透明即不能形成反胶束溶液），计算体系含水量W0。（体系中含水量 Wo是指反胶束体系中水(缓冲溶液)与表面活性剂的物质的量之比, 即WoH2O/S总。）若形成反胶束溶液，则继续进行2.2.5.3步骤。表6 CTAB/正辛醇反胶束体系萃取生姜蛋白酶编号AOT溶液体积mL0.1MKCl溶液体积mLW0是否形成反胶束1100.182100.273100.36分别以0.2M KCl、0.4M KCl、0.1M NaCl、0.2M NaCl、0.4M NaCl溶液代替表中0.1M KCl溶液，同法操作。2.2.5.3 CTA

34、B/正辛醇反胶束萃取生姜蛋白酶移取10mL生姜蛋白酶提取液加入上述CTAB/正辛醇反胶束体系中，搅拌萃取60min，静置分层后，测定上下相体积，并从下相中取样测定蛋白含量和蛋白酶活（上相中蛋白含量和酶活由总蛋白和总酶活减去下相而得）。按以下各式计算相比R、酶分配系数Ke（比酶活）、蛋白分配系数Kp： 2.2.6 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝 G-250法5测定蛋白质浓度。考马斯亮蓝 G-250 溶液的配制：准确称取 250 mg 考马斯亮蓝 G-250，用 125 mL 浓度 95%的乙醇溶解后加入 250 mL 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至 500 mL，过滤至棕色瓶中，4保存备用，使用

35、前进行五倍稀释。2.2.6.1 标准曲线绘制以牛血清白蛋白为标准品，用蒸馏水配成 0.1mg/mL 的标准溶液，按表7加入各反应试剂后，于210 min 内测定595 nm波长处吸光度，绘制牛血清蛋白质量A595标准曲线，建立标准曲线方程。表7 牛血清清蛋白标准曲线制作加样表管号12345670.1mg/mL牛血清清蛋白溶液/mL00.10.20.40.60.81.0蒸馏水/mL1.00.90.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250 /ml5.05.05.05.05.05.05.0标准蛋白质质量/mg00.010.020.040.060.080.10A5952.2.6.2 样品蛋白含量的测

36、定取待测样品1 mL，按表5中的7号管加入试剂，于210 min 内测定595 nm波长处吸光度（以表7中1号管为空白对照）。根据标准曲线方程计算样品中蛋白含量。2.2.7 生姜蛋白酶活力测定按文献6方法进行生姜蛋白酶活力的测定。生姜蛋白酶活力的定义：在50、pH6.0条件下，每分钟水解酪蛋白产生1g 酪氨酸的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位。2.2.7.1 酪氨酸标准曲线的绘制取酪氨酸标准样（105烘 3h）用 0.2mol/L的盐酸配成0、20、40、60、80、100 g/mL 的酪氨酸标准溶液，以 0.2 mol/L 的盐酸为对照测定不同浓度酪氨酸溶液在 275 nm 下的吸光度。以酪氨

37、酸浓度为横坐标，A275值为纵坐标绘制标准曲线，建立标准曲线方程。2.2.7.2 样品蛋白酶活力的测定在干燥洁净试管内加入1%酪蛋白1 mL，置于 50 水浴中预热 2 min，再加入经同样预热的酶液 1 mL（酪蛋白溶液与酶液均以 0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液配制），精确保温反应 4 min后，立即在每管中加入 0.4 mol/L 三氯乙酸 4 mL终止反应，待残余蛋白质沉淀后过滤，取滤液测定A275。空白实验测定方法同上，唯在反应之前先将 0.4 mol/L 三氯乙酸4 mL加入至1mL酶液中预热，使酶失活后，再加入至酪蛋白溶液中进行反应。冷至室温后的空白实验管

38、用作仪器校零。根据A275值所对应的酪氨酸的含量，按以下公式计算酶的比活力：生姜蛋白酶比酶活 = 式中：A 为测得A275值后，查标准曲线所得的酪氨酸的含量，g/mL；t 为酶促反应时间，定为 4 min；V 为反应液的体积，6 mL；B 为酶液蛋白含量，g/mL；v 为酶促反应所用酶液的体积，为 1 mL；1000 为 1 mg 相当于 1000 g的系数。3 结果与讨论3.1 标准曲线的绘制3.1.1 牛血清蛋白标准曲线表8 牛血清蛋白标准曲线的测定牛血清蛋白质量mg00.010.020.040.060.080.1A59500.00830.2180.3410.4240.5470.5763.

39、1.2 酪氨酸标准曲线表9 酪蛋白标准曲线的测定牛血清蛋白质量g/mL020406080100A275500.02840.06360.090.10480.11823.2 生姜蛋白酶常规工艺提取按2.2.1方法对生姜蛋白酶进行提取和常规纯化，并测定其蛋白含量和酶活，结果见表10。表10 生姜蛋白酶分离纯化结果样品总蛋白（mg）总酶活(IU)比活力(IU/mg)回收率(%)纯化倍数生姜蛋白酶溶液A130.33 1758.55 13.49100 1 生姜蛋白酶溶液B7.71 115.26 14.96 6.551.11生姜蛋白酶溶液C13.78 14.80 1.0710.84 0.08 生姜蛋白酶溶液

40、D99.8799.871 12.1915.860.90注：样品体积均为20mL表10结果表明，在四种常规的生姜蛋白酶的提取纯化方法中，乙醇沉淀法制备的生姜蛋白酶回收率和纯化倍数均优于其他方法，因此在后续实验中采用乙醇沉淀法对生姜蛋白酶进行初步纯化。3.3 生姜蛋白酶聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取3.3.1 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系的相图3.3.2 萃取效果的影响因素表11 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取生姜蛋白酶实验结果编号PEG分子量PEG浓度（%）硫酸铵浓度（%）相比R蛋白分配系数Kp比酶活分配系数Ke1400018180.690.54 4.22 2400018160.860.870.4

41、4340001813.64400016180.560.672.09 5400016160.660.77 0.52 640001613.60.710.790.48 7400013.6180.49 0.65 0.02 8400013.6160.60 0.75 0.61 9400013.613.60.670.940.323.3.2.1 聚乙二醇分子量对萃取效果的影响根据表11的结果计算出不同PEG浓度时的Kp和Ke平均值如表12，结果如图4所示。表12 不同PEG浓度时的Kp和Ke平均值PEG浓度（%）Kp平均值Ke平均值180.80392.3328160.74211.028813.60.78120

42、.3979由图4可知，在18%PEG、16%PEG、13.6%PEG三种浓度下对生姜蛋白酶进行萃取，其平均Kp为0.7758，三种PEG对生姜蛋白酶的萃取分配系数均小于1。所试验的，说明在此条件下，蛋白酶主要分配于下相。从生姜蛋白酶萃取效果来看，PEG浓度为18%、16%和13.6%时，其对应的Ke平均值分别为2.3328、1.0288和0.3979，可见采用18%PEG所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。3.3.2.2 聚乙二醇浓度对萃取效果的影响根据表11的结果计算出不同硫酸铵浓度时的Kp和Ke平均值如表13，结果如图5所示。表13 不同硫酸铵浓度时的Kp和Ke平均值硫酸铵浓度（%

43、）Kp平均值Ke平均值180.61963.16160.79820.481013.60.90930.3979由图5可知，在18%PEG、16%PEG、13.6%PEG三种浓度下对生姜蛋白酶进行萃取，其平均Kp为0.7758，三种PEG对生姜蛋白酶的萃取分配系数均小于1。所试验的，说明在此条件下，蛋白酶主要分配于下相。18%硫酸铵分配系数最小，表面下相蛋白含量最高，萃取效果最好，13.6%硫酸铵浓度下结果反之。从生姜蛋白酶萃取效果来看，PEG浓度为18%、16%和13.6%时，其对应的Ke平均值分别为3.16、0.48和0.3979，可见采用18%PEG所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。

44、3.4 ·生姜蛋白酶聚乙二醇/磷酸盐双水相体系萃取3.4.1 聚乙二醇/磷酸盐双水相体系的相图根据表3测得的数据结果，可以做出如下图6的PEG/PBS双水相体系的相图。3.4.2 萃取效果的影响因素按2.2.3.2方法，分别改变聚乙二醇分子量、聚乙二醇浓度、PBS浓度和pH进行分相和萃取实验，结果见表14。表14 聚乙二醇/PBS双水相体系萃取生姜蛋白酶实验结果编号PEG分子量PEG浓度（%）PBS浓度（%）PBSpH相比R蛋白分配系数Kp比酶活分配系数Ke1400018186.00.77270.3408-11.6282400018166.00.95000.3802-1.927340

45、001813.66.01.13330.50338.2434400016186.00.78180.38583.9965400016166.00.86540.40701.466640001613.66.00.98000.4463-164.6717400013.6186.00.61290.44632.7998400013.6166.00.54690.27144.1399400013.613.66.00.82690.4854-65.15610400018186.50.74070.72880.29211400018166.50.92000.58460.49501240001813.66.50.98000

46、.52200.01613400016186.50.71930.37281.99714400016166.50.61290.287736.8641540001613.66.50.88000.5231-231.30416400013.6186.50.53850.3860-6.83617400013.6166.50.65000.46812.58218400013.613.66.50.8824 0.69781.14119400018187.00.87500.60542.97820400018167.00.66670.21880.2322140001813.67.00.88240.3022121.648

47、2240001618 7.00.59320.29604.93323400016167.00.63930.34532.1532440001613.67.00.74550.31951.16725400013.6187.00.50770.28785.88726400013.6167.00.60000.38025.02027400013.613.67.00.66670.3923-16.857结果表明，在不同浓度的PEG和PBS下均可以形成双水相体系。但在不同的PEG浓度下，蛋白分配系数Ke的值不尽相同，Kp的值也是如此。PEG浓度越大，Kp值越大。然而PBS浓度越小，Ke的值越小。3.4.2.1 聚乙

48、二醇浓度对萃取效果的影响根据表14的结果计算出不同PEG分子量时的Kp和Ke平均值见表15，结果如图7所示。表15 不同PEG浓度时的Kp和Ke平均值PEG浓度（%）Kp平均值Ke平均值180.52722.0428160.41882.618613.60.41883.5947由图7可知，对生姜蛋白的萃取效果而言，16%PEG和13.6%PEG时，数值最小，蛋白质含量最高，即蛋白萃取效果最好。从萃取蛋白酶的效果来看，在13.6%PEG时的Ke数值最大，可见在浓度为13.6%时生姜蛋白酶的萃取效果最好。3.4.2.2 磷酸缓冲液pH对萃取效果的影响根据表14的结果计算出不同pH的PBS缓冲液对应的K

49、p和Ke平均值见表16，结果如图8所示。表16 不同PH的PBS缓冲液对应的Kp和Ke平均值PBS pHKp平均值Ke平均值60.40014.12626.50.48441.523270.34973.1957由图8可知，在6，6.5,7.0三种PH值下对生姜蛋白进行萃取，三种pH对生姜蛋白的萃取分配系数均小于1。pH6.5时分配系数最小，表面下相蛋白含量最高，对生姜蛋白萃取效果最好。从生姜蛋白酶萃取效果来看，pH值为6,6.5,7.0时，其对应的Ke平均值分别为4.1262、1.5232、3.1957，可见采用pH6时所构成双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。3.4.2.3 磷酸盐浓度对萃取效

50、果的影响根据表14的结果计算出不同浓度的PBS缓冲液对应的Kp和Ke平均值见表17，结果如图9所示。表17 不同浓度的PBS缓冲液对应的Kp和Ke平均值PBS浓度（%）Kp平均值Ke平均值180.41563.2690160.37152.298213.60.46583.5170由图9可知，16%宁都时分配系数最小，表面其下相蛋白含量最高，对生姜蛋白萃取效果最好，从生姜蛋白酶萃取效果来看，PBS浓度为13.6%，16%，18%时，对应的Ke平均值分别为3.5170、2.2983、3.2690，可见采用PBS为13.6%所构成的双水相体系对生姜蛋白酶的萃取效果最好。3.5 生姜蛋白酶AOT/异辛烷反

51、胶束体系萃取表18 AOT/异辛烷双水相体系萃取生姜蛋白酶实验结果编号KCl浓度（mol/L）W0相比R蛋白分配系数Kp比酶活分配系数Ke10.1200.74 8.17 0.2520.1300.9875.7610.7430.1400.7319.19 3.23 40.2200.8627.81 0.2150.2300.65 14.29 0.11 60.2400.82 68.83 0.26 70.4200.92 10.070.5080.4300.74 19.19 0.0390.4400.8112.60 0.66 表19 AOT/异辛烷双水相体系萃取生姜蛋白酶实验结果编号KCl浓度（mol/L）W0相比R蛋白分配系数Kp比酶活分配系数Ke10.12020.13030.14040.22050.23