毕业论文（设计）-试论蛋白酶

1、青岛农业大学本科生毕业论文论文题目试论蛋门酶学生专业班级学生姓名(学号)(20093344)指导教师完成时间2011-8102011年 8月 10 日中文摘要:蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分了内部切 断，形成分子量较小的月示和豚。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或 竣基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者 为竣基肽酶。按其活性中心和最适ph值，乂可将蛋白酶分为丝氨酸 蛋白酶、疏基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最 适ph值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。工业生产上 应用的蛋白酶，

2、主要是内肽酶。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎 叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵 母、放线菌生产。催化蛋白质水解的酶类。种类很多，重要的有胃蛋 白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋 白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋 白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽 键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物 中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用 枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵 关键词： 蛋白酶、蛋白的提取方法、蛋白酶的纯化方法、蛋白酶活性检测目录一、中文摘要、关

3、键词2二、目录3三、论文正文4（1）引言4（2）第一章蛋白酶的提取方法（3）第二章 蛋白酶的纯化方法（5）第三章 蛋白酶的活性检测方法（6）第四章蛋白酶的应用前景，存在的问题10参考文献11引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其 分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的月 示和腺。外肽酶从蛋白质分了的游离氨基或竣基的末端逐个将肽键水解，而游离 出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为竣基肽酶。按其活性屮心和最适ph值，又可 将蛋口酶分为丝氨酸蛋口酶、筑基蛋口酶、金属蛋口酶和天冬氨酸蛋口酶。按其 反应的最适ph值，分为酸性蛋白酶、小性蛋白酶和碱性

4、蛋白酶。工业生产上应 用的蛋白酶，主要是内肽酶。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微 生物中。微生物蛋白酶，主耍由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。催化蛋 白质水解的酶类。种类很多，重耍的冇胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜 蛋白酶和枯草杆菌蛋口酶等。蛋口酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种 蛋白酶仅能作用于蛋白质分子屮一定的肽键，如胰蛋白iw催化水解碱性氨基酸所 形成的肽键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中 含量丰富。第一章 蛋白酶的提取方法口前已开发利用的植物蛋白卿主要有木瓜蛋白«( papain)、菠萝蛋 白酶(bromelain)、生

5、姜蛋白酶 ginger protease, zingibain)等1,作 为食品添加剂，用于肉质嫩化、啤酒澄清等。也可用于医跖上，如菠萝蛋口 酶可溶解纤维蛋白及血凝块，可以治疗水肿及多种炎症2。我用罗汉果蛋 白酶的提取来说明蛋口酶的提取方法。蛋口酶的提取分离方法很多，如盐 析法、层析法，还有电泳、超滤等技术3。1材料与方法1. 1材料与仪器罗汉果；所用试剂为国产分析纯。752紫外光栅分光光度计、phs- 3c 精密ph计上海精密科学仪器有限公司；超滤器蠕动泵北京信康亿达科技发 展有限公司；超滤膜(sum，328d, 30kda)北京圣万泉膜分离设备有限公司; 冷冻干燥机吉林大学仪器技术发展公司

6、。1.2实验方法1.2. 1罗汉果蛋白酶活力测定4酶活力单位定义：在规定条件下，lmin内酶水解酪蛋口释放出相当于1 ug/ml酪氨酸在 275nm波长处的吸收度为1个活力单位。1.2.2膜通量j的测定5用烧杯接滤过液，同时用秒表计时，用滤过液体积除以相应时间表示。1.2.3罗汉果蛋白酶活力回收率的测定按各自工艺流程进行提取，最后进行真空冷冻干燥，所得酶粉的活力与所用罗汉 果果汁的总活力相比，即为其冋收率。1.2.4罗汉果蛋白酶的提取鲜罗汉果榨汁，离心(4000r/min, 20min)果汁。1.2.4. 1乙醇沉淀法用无水乙醇(-20°c)与100ml的罗汉呆汁配 成体积分数为30

7、%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇罗汉果汁溶液，混 匀，4°c放置30min,然后进行离心(4000r /min, 15min),收集沉淀， 真空中除去乙醇并冷冻干燥后，称重，测定酶活，并用最佳乙醇浓度所捉得的产物的酶活数据计算酶活回收率。1. 2宁沉淀法各取罗汉果汁90ml,加入不同浓度的单宁溶液， 使溶液中单宁浓度分别为 0. 01%、0. 04%、0. 08%、0. 12%、0. 16%、0. 20%、 0.24%、0. 28%,然后进行离心(4000r/min, 15min),收集沉淀，冷冻 干燥，称重，测定酶活，并用最佳单宁浓度所提得的产物的酶活数据 计算酶活

8、回收率。1. 4. 3超滤法超滤法提取罗汉果蛋口酶的方法为：罗汉果一洗 净压榨一静置一汁液离心(4000r/min, 20min)-清液一超滤f滤 后酶浆一真空冷冻干燥一罗汉果蛋白酶粉。最佳操作压力的的确定取7份相同体积的罗汉果汁，通过超滤 机压力表控制压力进行超滤，用秒表计算时间，测定不同压力下滤出 浓汁的酶活力，并计算不同压力下的膜通量j(ml/min)。最佳操作温度的确定分别将相同体积的罗汉果汁在水浴锅加热 至不同温度，然后在步骤".确的最佳恒定压力下立即超滤，测定滤后 浓汁的酶活力，计算不同温度卜的膜通量j(ml/min)。罗汉果汁浓度对膜通量的影响以步骤a确定的最佳恒定压力

9、下 超滤罗汉果汁，将原罗汉果汁浓度定义为0,用烧杯接不同时间的滤出 清液，用滤出清液体积除以原罗汉果汁体积，代表当吋的罗汉果汁浓 度，同时计算膜通量，比较二者的关系。每次罗汉杲汁量对酶超滤的浓缩度的影响每次用不同量的罗汉 果汁进行超滤，测最后滤过液的量，用其除以每次所用罗汉果汁的量， 即为超滤的浓缩度(%) o第二章蛋白酶的纯化方法生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的 酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶, 就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另 一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化

10、作用，称为细胞内 酶，如柠檬酸、肌昔酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种 酶催化卜在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布 区威，催化的反应具冇一定的顺序性，使许多反应能冇条不紊地进行。酶的来源多为牛物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但毎一种酶 的含量却很低，如胰脏屮期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别 很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如唳 脏是捉取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或 植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本乂很大。目前工 业上大多采

11、用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物屮来生产酶制剂 的优点冇很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶人都可以在微生物 中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种來提高产量，用廉 价原料可以大量生产。由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一 般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂吋，必须经过分纯化的手续。酶是具冇催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免 用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在捉纯的过程中通过测定酶的催化活性 可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性乂可以作为选择分 离纯化方法和操作条件

12、的指标，在整个0悔的分离纯化过程屮的每一步骤，始终要 测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高 了多少，从而决定着一步骤的取舍。酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽 捉、纯化、结品或制剂。首先将所需的酶从原料屮引入溶液，此时不可避免地夹 带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择 性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就iw的分离纯化的常用方法作一综 合介绍：一、预处理及固液分离技术1 细胞破碎（cell disruption）高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。 将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径

13、可调的排放孔屮，菌体从高压环境转到低压 环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞 破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码耍将菌悬液通过 均质器两次。最好是捉高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达 到175mpa时，破碎率可达100%。当压力超过70mpa时，细胞破碎率上升较为缓 慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀 门，尤其高浓度菌体吋更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠 菌更难破碎。容菌酶处理法：蛋清屮含冇丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做 法是：溶壁微球菌（mic

14、rococcus lysodeikticus）43kg,置于0. 5%的氯化钠溶液 屮，使细胞浓度为5% （干重），在35°c用0. 68kg （干重）的蛋清处理20min,得 到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去， 再色乙醇浓度提高到75% （体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500go2. 禺心离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有 过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁 上冇过滤介质，一般口j用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降 式离心机用于分离固体浓度较低的

15、固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有 机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度冇微小差别的 乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物 生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。 现代哦离心机装置包括以卜三个步骤，并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌 及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具冇双重轴向密封，密封由 装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防 止产詁被污染，也可防止生产过程屮排宙的废物对环境的污染。该离心机又如一 个密闭的压力容器，可

16、在121 °c温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设冇环绕离心 机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控 制温度，这对于生物制品是非常重要的。如btpx205型离心机可用于细胞收集、 培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅 助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面 传感器。3. 膜分离技术在蛋口质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过 孔径非常小的滤膜，使溶液屮分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜 表面。人多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在-起而组成

17、 的。功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的 优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没冇破坏。超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤 器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器 中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。超滤应用于蛋口质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以卜问题：第一，在超滤 循环过程屮，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会 造成蛋口质分子的损失。因此 料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制 系统。第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些嗨含

18、有辅助因子，其分子量小, 超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因 了。述可将超滤与亲和层析相结合以捉高分离纯度。英工作原理是：当溶液屮欲被分 离的蛋口质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基， 该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将 穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下來，洗脱液用于进一步的 分离纯化。4. 泡沫分离原理：将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性由差异，因此 在溶液的表面，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生 物学特性。泡沫中含冇更多的表面活性成分，故

19、泡沫的组分种类及其含量与溶液 中的不相同。这样，溶液中的组分舅得以分离。蛋白质较易吸附与气液界而，这有利丁其结构的稳定。泡沫分离过程是：蛋白质 从主体溶液中扩散到气液界面，该过程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子发 生重排，一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜，一种是稀膜，另一种是 浓膜，口j能会发生出多个分子聚集在一起的现象。在气液界面形成的蛋白质膜可 以是单层的也可以是多层的。膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特 性、结构和浓度。泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋口的富集率（泡沫中蛋口质的浓度/最初溶液 屮蛋白质浓度），另一方面提咼p悔蛋白的提取率（泡沫屮蛋白质的提取率/最初的 蛋

20、白质质量），或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。二、抽提、沉淀盐析常用的盐析剂是硫酸镀，其溶解度大、价格便宜。硫酸镀沉淀蛋口质的能力很强, 其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。ph的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最 小易沉淀，但有些酶再等电点时稳定性较差，因此耍选择最佳pll值一般耍求在 酶最稳定的ph值的前捉下再考虑最适宜酶沉淀的ph值。在操作屮一旦确定最佳 ph值后，在添加硫酸镀之前甲酸或碱调节好酶液的ph值，要尽量避免溶液ph 值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸鞍吋要注意搅拌，并注意硫酸钱的加 入速度，一般是曲少到多，缓慢加入

21、，硫酸鞍尽可能磨成细粉。温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而 对于大多数酶，尽可能在低温下操作。酶液的净置：加完硫酸鞍后，酶液要静置一段吋间，使晦蛋白完全沉淀下来，酶 静置后，就不要再加以搅拌。有机溶剂沉淀冇机溶剂选择：可用丁酶蛋白沉淀的冇机溶剂包括醇类物质等，如卬醇、乙醇、 异丙醇。乙醇的亲水性能较好，可防止蛋口质的变性，酶蛋口在其中的溶解度也 较低。冇机溶剂沉淀操作：冇机溶剂一般都使蛋白质变性，当温度较高时变性蛋白质分 了就会变成永久失活。因此用有机溶剂处理时最好在0°c以下进行。用有机溶剂 沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。聚合物絮

22、凝剂沉淀聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具有脱水作用使iw 沉淀。聚乙二醇作为-种沉淀剂的优点是在水溶液中，其浓度可达到50%,浓度 为6%-12%的蛋口质大都可以沉淀卜來。这种试剂不需要低温操作，而且对蛋口 质的稳定述冇一定的保护作用。聚乙二醇不会被吸附，故在离子交换吸附前不必 去除。用金属离子和络合物沉淀酶和其他蛋白质都会形成金属盐，其溶解度较低。用金属离子沉淀的缺点是酶与 金屈离了相互作用后，可逆变化较茅，尤其是用筑基衍生物，它结合的金屈离 子会催化酶变性而失活。用特殊试剂沉淀法用链霉素可选择性去除核酸，从而使胞内酶沉淀出来。链霉素盐（浓度为0. 5-l.omg/m

23、g蛋白质）对于选择性沉淀核酸的效果比镒离子还要好，酶不易失 活。亲和沉淀将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机 结合形成了亲和沉淀技术。将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物， 该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出來。配基-载体复合物可以选择性地与蛋口质结合，溶液中的pii值、离了强度及蛋白 质浓度等条件对亲和结合的彩响力并不大，只冇竞争性的配基会降低产物与原配 基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。引导产生沉淀的方法有：离子交联；加入带相反电荷的聚合物；加入带相反电荷 的疏水基团；改变ph值，诱导产生疏水沉淀；温度诱导产生沉淀。亲和结合：将亲

24、和配基加入到含有h的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条 件，使之冇利于亲和结合。洗涤：为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合，尤其是使 用带电的聚合物，离子交换的效应将使其他蛋白质共同沉淀，因此在分离口的物 之前要洗涤沉淀物。其做法是：加入适当的清洗剂重新溶解沉淀，再沉淀；或在 专一性洗脱z前，彻底清洗沉淀。在上述过程中耍始终保持目的蛋白质与配基处 于亲和结合状态。配基-载体复合物与目的蛋白质的分离：分离结束z后，要确 保冋收目的蛋口质和配基-载体复合物，目的蛋口质要达到一定的纯度，冋收率 要高。方法简介第三章蛋白酶的活性检测方法由于蛋白酶研究的兴盛，使蛋白酶活性测定的方法也

25、得到了发展。 这里简要介绍儿种各具特色的蛋口酶活力测定的新方法。dna/澳乙锭荧光分析法_|1基本原理澳乙锭插入双链dna的碱基对z间时，可使dna的荧光增加25倍 接 近饱和的澳乙锭(0. 5tg/m 1)与dna混合时，其荧光增加量与dna的浓 度呈正比。当蛋白质(如组蛋自)与d7a结合时，阻止了澳乙锭的插入，结 果，荧光消失。组蛋白与dna有非常高的亲和力，组蛋白加入双链dna溶 液时，全部结台到dna双链上，溶液中没有游离的组蛋白存在，直到所冇 结合部位都饱和。溶液荧光的卜降量与组蛋白的加入量呈止比。在dna-组蛋白一澳乙锭潜藏屮加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在d 链上的组蛋口，使dna

26、结合部位暴露出来，澳乙锭重新插入dna双链中， 荧光增加量与蛋白酶活性星正比。据此，通过测定dna溶液的荧光增量来 计算蛋白酶的活性。2酵活性测定方法2. 1直接荧光测定在17x75ram的硼酶玻璃管中，加入含有0. 5 / g / ml滇乙锭的 ph8.0的tris缓冲液1.2ml和10#1 dna 组蛋白复合物(其屮古0. 5fg 胸腺dna和1. 5fg完整组蛋白)，于37oc平衡5分钟后，加入约10111 蛋白酶，在一定的间隔时间内，测定荧光增量。激发波长为525nm,发 射波长为600nnio 1_2. 2间接荧光测定为了改善灵敏度，dna -组蛋白 的结合在5001 eppendo

27、rf管中进行 向eppendor管中加入1. 2ml含 0. 5/g/ml乙锭的ph8. 0的=rrig缓冲液，10/1 dna -组蛋白 混合液(含1_5 g组蛋白和0. 5 g dna),于37oc保温5分钟，充分混 匀后，取样10 1加入荧光管中，再加入10蛋白酶混匀后，测定荧光增ill1_3本方法的特点1_3. 1灵敏度高，足以在纳克水平定量测定多种蛋白卿活性。如可 检测10个细胞提取液中的蛋白酶活性。1_3. 2快速，适用于大量样品的测定。如蛋白酶分离纯化过程中， 测定麵化中间产物的酶活性，血清屮q1-抗胰蛋白酶活性等。1|3. 3结果稳定，重复性好。组蛋口与dna结合稳定，22oc

28、 10小 时内都很稳定，且不受离子浓度和变性剂的影响,如150retoolnaci. loretool mgc12 和 cact2 及 0. 02sds、0. 04 十二烷基肌氨酸、2 triton 等对组蛋口与dna的结合都无明显影响。此法还可同时测定蛋白酶抑制 剂。fja 法流动注射分析(flow injection analysis, f1a)是近年发展起来的又 一项应用广泛的分析测试新技木。fm具冇重复性好、反应迅速、省时、试 剂消耗少、适应性广等特点，已广泛用于分析化学、生物化学、临床检验 及食品分析等多种领威。目前f1a在酶活性检测屮也得到应用。下而介绍 用荧光标记底物测定蛋口酶活

29、性的fia法。1基木原理用荧光索异硫氧酸盐(fttc)标记蛋白酶底物牛血清白蛋& (bsa),然后 将标记的bsa偶联到2-f- 1 一甲基毗碇（fmp）活化的分离胶上，制成分析 柱。当酶液流过分析柱时，蛋口酶将标记在bsa上的荧光基团解离下来， 通过荧光光度计检测酶解流出液的荧光强度来测定蛋白酶的活性。为了消 除样品中可能存在的荧光物质对测定结果的影响，在分析系统中设置一个 与分析柱完全一样的对照柱仅以分离胶代替fitcbsa -分离胶待测酶 液通过分析柱测得的荧光强度，减去待测酶液通过对照柱所测得的荧光强 度，即为酶实际水解的荧光素的荧光强度。2测定程序首先用fttc标记bsa,然后偶联到用fmp活化的分离胶上.制成分析 柱。将分析柱代替hplc（或常压系统）中的层析柱。待测样品液注射进样后 由微量泵送人分析柱，酶经过分析柱时.将标记在bsa±的荧光基团解离 下来。酶解流出液经荧光检测仪测出荧光强度，由记录仪记录下来。3特点本法精确度高、结果可靠。因为酶解反应在恒温条件下进行，并设置 了对照柱，排除