小鼠肝DNA提取及鉴定

1、羂小鼠肝组织DNA的提取及其含量测定袀实验目的：罿1、掌握从组织细胞中提取 DNA的基本原理。薇2、掌握DNA提取和鉴定的方法。肂实验原理：芁本实验所用的是 DNA酚抽提法，是对1976年Stafford及其同事提出的方案的改进。可 用于多种来源标本的高分子量DNA样品的制备，包括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜组织以及血液标本等。蚁提取DNA的基本思路，DNA以核蛋白形式存在于细胞核中。利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。它是以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚进行抽

2、提，离心分层后，蛋白质因变性位于有机相与水相的界面，而DNA进入水相，再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染。重复抽提DNA至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需大小范围的高分 子量DNA样品。沉淀处理常以乙酸铵为沉淀用盐，用无水乙醇沉淀。莆其中EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。SDS为生物阴离子去垢剂，SDS可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分子分离，并能与脂质和蛋白质结合使他们沉淀，同时还有降解 DNA酶的作用。无DNA酶的RNA酶可以有效水解 RNA，而避免DNA的消化。蛋白酶 K或链

3、霉蛋白酶 E均为广谱蛋白酶， 其重要特性是能在 SDS和EDTA存在下保持很高的活性。将蛋白质降解成小肽或氨基酸， 可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，使 DNA分子完整地分离出来也有裂解细胞的作用。 酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性。氯仿可除去微量酚。莆实验材料：蚂 小鼠EP管、低温高速离腿器材:荿解剖盘、解剖剪、镊子、匀浆器、微量加样枪、烧杯、试管架、 心机、紫外分光光度计蒆试剂:肃生理盐水、10%的SDS溶液、饱和酚、氯仿：异戊醇（24:1）、无水乙醇、10mmol/L的乙 酸铵溶液、1XTE（pH8.0）缓冲液 （注：1XTE（pH8.0）缓冲液由 10mmol/L（pH=

4、8.0）的 Tris-HCI 和 1mmol/L （ pH=8.0 ）的 EDTA 配制而成）。袁操作步骤：、二、膈小鼠肝匀浆液的制备：薆 1、颈椎脱臼法处死小鼠，解剖，取肝脏组织一块于生理盐水中洗脱血液。蒄2、将洗脱的肝组织剪碎放入匀浆器中，在加入 5ml冷的TE缓冲液，进行充分研磨。制成匀浆液。芈二、提取DNA :袇1、取0.5ml匀浆液加入1.5ml的离心管中，加入 10% SDS溶液0.1ml，颠倒混匀后,室温5min。蚆2、在上述溶液中加入饱和酚12000rpm 离心 5min。0.25ml,氯仿:异戊醇（24:1） 0.25ml ,充分混匀，室温放5min ,蚀3、小心取上清液约

5、0.4-0.5ml，加入0.5 ml氯仿:异戊醇（24:1），混匀，室温放 5min , 12000rpm 离心 5min。肀4、取上清液0.2 ml，加入0.3体积（即60卩l）的NH4Ac , 2.5体积（即0.5ml）的无水乙 醇充分混匀，12000rpm离心5min，小心倒去溶液，吸干。 DNA沉淀加入1.0mlTE缓冲液 溶解。蚅三、DNA的含量测定螆取0.5ml DNA样品加TE缓冲液至4ml，用TE缓冲液调零，用紫外分光光度计分别测A260nm值和A280nm 值。肁结果记录与处理:蒈1、结果记录:蚈用紫外分光光度计分别测的A 260nm值为0.498, A 280nm值为0.3

6、622、3、螆结果计算：蒂A260nm/A 280nm=0.498/0.362=1.376双链DNA样品浓度（卩g/ml）=A 260nm X稀释倍数X 50=199.2卩g/ml蒇结果分析: 祎 DNA的质量鉴定包括浓度分析、纯度鉴定以及大小完整性的分析。浓度分析与纯度 鉴定，最简单快速的方法是紫外分光光度计。袃 1、通过A260nm/A280nm的比值可以分析其纯度，DNA纯品：A 260nm/A280nm = 1.8蚈RNA纯品：A260nm/A 280nm = 2.0。A 260nm/A 280nm的比值为匸8是咼纯度DNA的标志，咼于 或低于此值均表示不纯。但比值为1.8时的DNA溶

7、液也不能断定为纯的DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚与 RNA的污染。其中蛋白质与酚的污染均使比值下降，而RNA的污染则使比值升高，一般情况下，A260nm/ A280nm的比值在 1.75-1.80之间是可以接受的。但A260nm/A280nm的比值若低于1.75，则表明有显著的蛋白质污染。芆经计算此次实验所提取的DNA样品的A 260nm/A 280nm的比值为1.376明显低于1.75,可见样品中明显有蛋白质污染，可能是由于加入的 SDS未能充分混匀，致组蛋白未能与DNA 完全分离，可能由于酚未能与提取液混合充分，未能使蛋白质完全沉淀，更有可能是由于在第4步中吸取上清液时，吸到了蛋白质沉淀，

8、造成蛋白污染。羅鉴于A260nm/A280nm的比值低于1.75时，明显有蛋白质污染，此时需要加入终浓度为0.5%的SDS,并重复提取 DNA步骤中的2-4。羀 2、通过A260nm值可以定量，核酸在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大 约相当于50卩g/ml的双链DNA、40卩g/ml的单链DNA或RNA、20卩g/ml的寡核苷酸。 但 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25卩g/ml的核酸溶液。莀双链DNA样品浓度（卩g/ml） =A 260nm X稀释倍数X 50羅据此计算出本次实验的 DNA样品浓度为199.2卩g/ml。肅注意事项：莁1、对组织标本的高分子量 DNA提取时，最好是新鲜标本，需要首先清楚血液和筋膜 等纤维结缔