抗冻基因KN2表达载体的构建及大麦遗传转化的研究

1、 分类号 密级华中农业大学硕士学位论文抗冻基因表达载体的构建及大麦遗传转化研究研究生:万萌学 号:指导教师:孙东发教授指导小组:孙东发教授孙根楼教授专 业:作物遗传育种 研究方向:麦作遗传育种获得学位名称:农学硕士 获得学位时间:年月华中农业大学植物科学技术学院二。一三年六月华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文如需保密,解密时间 年 月 日是否保密雷独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果.尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使过的

2、材料,指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何奉献均已在论文中做了明确的说明,并表示了谢意。蝴:矽弓年乡月弓日研究生签名:汤鲡学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定,即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印制版和电子版,并提供目录检索和阅览效劳,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或局部内容,为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换效劳,同时本人保存在其他媒体发表论文的权力。注:保密学位论文即涉及技术秘密、商

3、业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文在解密后适用予本授权书.四黼张乃翻翩始参欢签名日期:劢心年易月弓日 签名日期:凇乃年么月岁日注:请将本表壹接装订在学位论文的扉页和目录之间抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究目录摘 要?.?.?.第一章文献综述.大麦遗传转化技术研究现状与进展?.大麦的遗传转化方法.基因枪转化法?.电穿孔?.显微注射?.花粉管通道法?.农杆菌介导法?.转基因技术在大麦研究中的应用?.大麦抗病害研究.环境胁迫抗性应用?.大麦品质改进应用?.植物抗冻基因工程研究进展?.抗冻基因的来源.抗冻基因的应用.抗冻蛋白基因?.脯氨酸基因?.脂肪酸去饱和酶基因?.超氧化物歧化酶基因?研究

4、的目的意义第二章大麦幼胚再生体系的建立材料和方法.材料.培养基?.大麦愈伤组织的诱导、继代培养、分化及植株再生华中农业大学届硕士学位毕业论文结果统计及分析.统计方法?.幼胚愈伤组织的诱导与再生?.不同基因型对幼胚愈伤组织诱导及分化的影响. 对幼胚愈伤组织诱导的影响.第三章基因表达载体的构建与遗传转化实验材料与方法.材料?.实验方法.基因表达载体的构建.基因表达载体构建策略?.引物设计与反响条件.割胶回收目的片段.载体的连接?.法制备大肠杆菌感受态细胞.质粒向大肠杆菌的转化?.测序?.质粒提取:.质粒酶切与连接?.载体的构建.农杆菌介导的大麦遗传转化?.大麦组织培养过程中的培养基制备.电转化农杆

5、菌感受态细胞的制备.质粒转化农杆菌?.农杆菌标准培养物的制备.侵染和共培养?.筛选培养和植株再生.转基因大麦植株检测结果与分析?抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究.基因表达载体的构建.基因的扩增与载体连接?.表达载体 的构建向农杆菌的转化?.表达载体.农杆菌介导的遗传转化?.农杆菌介导幼胚的转化及植株再生.转基因大麦植株检测?.第四章讨论大麦幼胚再生体系的建立表达载体构建中的影响因素?农杆菌介导的遗传转化参考文献?附录:缩略语表附录:常用培养基及其它试剂和抗生素母液配方?附录:基因编码序列致射.抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究摘要大麦.是世界重要的粮食作物,在全球范围内广泛种植,是啤酒和

6、饲料的主要原料。经过近十年的开展,大麦基因工程研究得到了广泛的应用,在大麦品质改进、抗病研究和抗胁迫等领域获得了很多具有积极意义的成果。近年来,全球气候变化无常,自然灾害频繁发生,其中冻害已经对大麦的生产造成了严重的影响,随着转基因技术的开展,将优良的外源抗冻基因转化到大麦中去,可显著提高大麦的抗冻性。本研究以不同大麦品种为材料建立了大麦幼胚再生体系,构建了高效的抗冻基因表达载体,并且对其进行了遗传转化研究。得到的研究结果如下:以个大麦品种美里黄金,华大麦号,华大麦号的幼胚为试验材料,建立了大麦再生体系并比照了这四个品种之间的差异。研究结果说明:这四个品种的离体培养效果都很好,均可作为遗传转化

7、的受体,诱导培养基中添加./的对胚性愈伤组织的形成和再分化有促进作用。以植物表达载体为根底,通过在引物的两端分别设计酶切位点和,采用载体与扩增的目的基因连接。分别酶,胶回收酶切产物并连切带有目的基因的载体和高效表达载体,并将其导入农杆菌接,得到含抗冻基因的高效表达载体菌株,为农杆菌介导的抗冻基因遗传转化研究夯实了根底。农杆菌介导大麦的遗传转化研究:试验中以美里黄金、华大麦号和华大麦号这四个基因型的幼胚作为转化受体,采用农杆菌介导法对抗冻基因进行了遗传转化研究。最后得到株抗性大麦植株,初步分子检测结果显示,其中的株为阳性植株。关键词:大麦;再生体系;幼胚;抗冻基因;农杆菌介导的遗传转化华中农业大

8、学届硕士学位毕业论文 ., ,.,., .?. : /.,./ .?. . , ,.? . ; ; ;:;? 抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究第一章文献综述大麦遗传转化技术研究现状与进展大麦的种植总面积和种植总产量仅低于小麦、水稻、玉米,是禾本科大麦属的一年或越年生草本植物。大麦是自花授粉的二倍体植物中基因组比拟小的、适于遗传学和生理学研究的重要模式作物,在全球范围内广泛种植。在大麦的多个品种中,二棱大麦亚种和多棱大麦亚种是种植面积最为广泛的品种。大麦主要用于动物饲料、啤酒生产、健康食品、医药原料等许多方面 .,。大麦还有许多优良特性如:早熟、短生育期、极强的气候适应性以及轮作适合等。在以

9、往大麦的育种研究领域中,主要采用的是常规的杂交育种手段,传统的育种技术具有诸多缺点,如一般只能在生物种内实现基因转移,可利用的基因资源受限,基因在转移的过程中无目的性,大量的不良基因也可能一起转移,后代的基因别离具有不缺点性,后期的育种工作量巨大,稳定性差,育种年限长等。为加快农业的快速开展,促进农作物新品种的形成,转基因技术在作物育种领域得到了广泛的应用,转基因技术可以将优良基因有目的性的转移到作物中去,基因的来源广泛,打破了不同物种间的杂交障碍,基因在后代的表现可精确预期,缩短了育种年限,而且转基因技术还可以与常规育种技术紧密结合,培育出更多的优良品种。自第一株转基因大麦获得后 .,特别在

10、组织培养技术不断进步的支持下,转基因技术在大麦育种中广泛应用,并得到了许多有益成果。.大麦的遗传转化方法随着大麦转基因技术的不断开展,其遗传转化方法也趋于多样化,包括直接转化法如:微粒轰击 ,电穿一孑,花粉管通道法,显微注射等,而农杆菌转化法那么是主要的间接转化法。.基因枪转化法基因枪法的原理是采用高压气体或者火药爆炸等产生动力并驱动外表含有转华中农业大学届硕士学位毕业论文化基因的金属颗粒,以极快的速度射入生物体内,由于速度极快,植物体不需要去除细胞壁和细胞膜,就可以将目的基因导入细胞内,从而整合入作物基因组中,实现了基因的转移。该法由美国生物学家率先提出,通过近年的开展,现在基因枪转化技术已

11、经在水稻、小麦、玉米、大豆等许多作物上得到了应用,而且该技术还可以转化很多其他方法难以转化的植物。基因枪法在实际的应用方面具有很多优点,由于采用的是高压气体驱动,其中的许多条件可精确控制;金粉上附着的基因来源广泛,可以从不同生物体内获得;目标受体的类型不受限制,可以是幼胚、愈伤组织、原生组织;而且基因枪法还是细胞器遗传转化的有效技术。但是基因枪技术也有缺点,在高压气体驱动过程中,外源基因可能会发生断裂,导致插入的基因失活;基因枪转化法常常会将多拷贝导入受体基因组中,导入的基因会发生多种重排,而且同源序列会以多种方式相互作用,导致基因沉默现象的发生;同时基因枪法的随机性和高费用也是其主要缺点。和

12、首次将含基因与基因的质粒通过基因枪法导入大麦中去,得到转基因植株,目的基因在后代中稳定遗传和表达,并且在实验中以大麦幼胚、愈伤组织、小孢子等建立起来的基因枪转化体系具有高效、快速、可行性高等优点。近年来,基因枪法在大麦育种领域中应用广泛,已将不同来源不同用途的优良基因导入大麦中去,获得了许多优良成果。 .,。.电穿孔电穿孔又称电击法,该技术可以将等其他类的生物大分子导入细胞内部进行研究,如蛋白分子、糖类分子、病毒颗粒等。其主要原理是利用高压电磁脉冲,使处在高压电场中的细胞的细胞壁和细胞膜外表发生小孔,改变细胞壁与细胞膜的通透性,促进其他生物大分子的导入。电穿孔具有操作方便、低毒性、用途广泛等优

13、点。在大麦的遗传转化领域得到应用,并取得了一些成果。年,.等通过高压电场处理大麦愈伤组织的原生质体,通过电击法成功的将外源基因导入原生质体中,在得到的株转基因植株中,目的基因在后代中都得到了稳定的表达。电击法在实际的操作过程中往往会造成原生质体的严重损伤,并且电击仪也比拟昂贵。在大麦转化中,电击法并不常用。抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究.显微注射显微注射法是使用毛细微管一般针尖的直径为.,在显微镜下将外源物质如外源基因、片段、信使核糖核酸、蛋白质等注入植物细胞或原生质体的一种直接而完善的方法。采用此方法转化植物时需要严格的操作技术和组织培养技术。在植物的基因转化方面,成功的案例不多,年,

14、等采用此技术将基因注入大麦的原生质体细胞中,成功的获得了两个稳定遗传的柱系,说明显微注射技术在作物转基因领域具有良好的前景。.花粉管通道法在植物开花授粉后的一段时间内,通过向子房中注射一定量的溶液,使溶液能沿着花粉管渗入,通过珠心管道进入胚囊中,将目的基因整合到植株基因组中的方法便是花粉管通道法,该方法是年由周光宇发现并建立起来的。花粉管通道法转化实质是受精过程转化。这种技术的原理可以应用于任何开花的植物。近年来花粉管通道法开展迅速。虽然学术界对花粉管通道法还存在诸多争议,但由于该转化技术在设备和技术上的低要求,还可以转移多基因控制的数量性状,目前花粉管通道法已经在大麦、棉花、大豆等作物的遗传

15、转化方面成功应用,并获得了相应的转化植株。.农杆菌介导法双子叶植物在生长时根部往往会出现冠瘿瘤的形成。年,等发现在土壤中无农杆菌的情况下,植株依然会发生冠瘿瘤的形成,对此,他猜想是一种可以脱离农杆菌的遗传因子导致了冠瘿瘤的形成,并提出了冠瘿瘤诱导因子假说。和 发现农杆菌的致病能力与其体内的质粒的存在与否有着明显的关系,通过实验发现,丧失致病能力的农杆菌菌株中质粒全部丢失,并推测冠瘿瘤诱导因子就是质粒。等在产生冠瘿瘤的植株中发现一段外源片段,通过对其基因序列的比对发现,其与农杆菌中质粒的一段序列高度吻合,从而推测从致病植株中发现的是通过农杆菌介导进入植株体内的。此后,由农杆菌介导的植物遗传转化进

16、入了新的开展时期。华中农业大学届硕士学位毕业论文目前,应用于植物的遗传转化技术主要是基因枪法和农杆菌介导法,由于基因枪介导法的随机性、不稳定性、易丧失和基因沉默现象的普遍存在,导致了外源基因不能在宿主植株内稳定遗传和表达,而农杆菌介导法是一种天然的遗传转化体系,具有较高的转化效率、低拷贝数、遗传稳定、转基因沉默现象少等优点,。由于单子叶植物对农杆菌没有明显的创伤反响,该转化技术对单子叶植物进行遗传转化时比拟困难。在大麦遗传转化研究方面,农杆菌介导法的起步较晚,但大量的研究成果说明,该技术是有效的大麦遗传转化方法。在农杆菌介导的大麦遗传转化中,转化受体有幼胚、成熟胚诱导的愈伤组织、花药或小孢子愈

17、伤组织等多种形式。其中幼胚由于较高的愈伤组织诱导率、技术成熟、操作简便且转化效率高,已经成为大麦农杆菌转化的主要受体。等利用农杆菌介导法得到的大麦转基因植株中,发现其中的%是单拷贝。在农杆菌介导大麦遗传转化的实际操作过程中,良好的组织培养技术对转化效率有明显的促进作用。研究说明,不同大麦品种之间其愈伤组织的诱导能力存在着明显差异,目前大麦转基因研究的主要品种是 ,其再生体系建立相,对容易,是最早被基因枪介导法和农杆菌转化法成功转化的品种。不受病害影响、营养充分、未喷洒农药的大麦植株会获得比拟好的转化结果,。研究说明,大麦幼胚的大小对农杆菌介导的转化效率有很大影响,一般.一.直径的大麦幼胚是最适

18、宜的,等用基因枪对大麦幼胚进行创伤预处理,发现农杆菌侵染更加容易。等研究说明,将未成熟胚进行天的预培养处理,农杆菌转化后的报告基因瞬时表达量明显增加。目前,、和等农杆菌菌株广泛应用于植物的遗传转化。其中农杆菌具有极高的毒性,转化效率是普通菌株的数倍以上,但是极高的毒性导致其在转化后期的抑菌难度加大 ,。等认为,共培养,对农杆菌的转化效率有显著提升。等发现在侵染液中添加乙酰丁香酮可以速进向受体细胞的转移。在大麦再生体系建立过程中,培养基可促进幼胚愈伤组织的诱导能力有助于其遗传转化 ,在激素的使用方面,的效果要优于,. 。抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究.转基因技术在大麦研究中的应用.大麦抗病

19、害研究黄花叶病,是由大麦黄花叶病毒引起。病状主要表现为轻病株大麦抽穗后,上半部叶片的病症有所消退,重病株不能抽穗,黄色花叶转成黄色条斑,叶脉呈黄绿色,颖壳也生黄斑。二棱大麦染病现锈褐色坏死斑纹,后期叶片变深黄色,植株略矮,易枯死或不抽穗。黄花叶病是长江流域及江苏、安徽、湖北、上海等省市大麦上的主要病害。年,等利用农杆菌介导法将具有黄花叶病抗性大麦品种和.基因编码序列转入敏感品种中去,发现后代转基因植株的抗病能力显著增强。.基因是一种对大麦黄花叶病毒产生抗性的功能基因,其在病毒侵染过程中具有调控能力。白粉病,自幼苗到抽穗均可发病,由白粉菌感染而发病的一种真菌性病害,白粉病的发病区域主要在潮湿温和

20、的地方,其主要危害大麦叶片,也危害茎和穗子。一般情况下部叶片比上部叶片病害严重,得病期间叶片的光合作用降低,新陈代谢紊乱,进而造成产量的严重损失。由于近年来,大麦种植密度的不合理,氮肥等施用量增加,进而造成白粉病染病区域不断扩大,对大麦生产造成不利影响。片细胞对白粉病病毒的敏感性。大麦条纹病是大麦的重要病害和防治对象,严重危害大麦叶片的生长,初期叶片现黄斑或细小的条纹,后随叶片生长,下部叶片和新生叶片依次发病,至拔节抽穗期,多数发病叶片边缘褐化,并长出黑色霉层,病株矮小或枯死,最终导致大麦减产。等在大麦品种别离出条纹病抗性基及其启动子区域,并采用农杆菌介导法将其转入无抗性品种 ,获得了转基因抗

21、性植株。大麦黄矮病是由大麦黄矮病毒引起,依靠蚜虫在作物植株间传播,在全国范围内普遍发生,常导致大麦、小麦、玉米、水稻等禾本科作物大规模减产。病状表现为植株矮小、叶片变黄,早期发病植株会严重矮化,抽穗期发病常造成大华中农业大学届硕士学位毕业论文麦产量的减少或品质的下降。等通过基因枪转化法将外壳蛋白品种,并得到个株系的转基因苗,通过抗病检测发现基因转入大麦共有颗植株具有黄矮病抗性。等采用农杆菌介导法将构建好的含有中,由于这段序列可以形成病毒基因序列的片段转入大麦发卡结构,可抑制病毒的感染,发现个株系的植株产生极强的抗病性。.环境胁迫抗性应用随着气候的无常变化及生态环境的破坏,干旱、冻害、盐碱、金属

22、离子等不良环境因素已经对作物的生长发育造成严重危害。许多植物在进化与适应过程中,其体内积累了很多可以协助其抵御这些环境胁迫的基因。通过转基因技术,可充分利用这些基因,促进农业的开展。硫氧还蛋白 是大局部生物中共有的小蛋白家族成员,其中包含一个二硫键的氧化复原活性中心。近期的研究发现硫氧还蛋白与抗氧化胁迫有关,硫氧还.,使其在植物应对氧化胁迫损伤蛋白可以与多种抗氧化酶相互作用中具有重要作用。等通过基因枪介导法将硫氧还蛋白基因转入大麦,得到了转基因植株。通过对转基因植株后代生理代谢分析,发现后代对亚硒酸盐摄取速度显著加快,亚硒酸复原能力也得到明显提高。在高浓度的亚硒酸盐生长环境下,转基因株系具有更

23、好的适应性。等采用农杆菌介导法将小麦基因导入大麦品种中,成功获得了转基因植株,该基因的表达产物苹果酸运输载体可以协助大麦抵抗铝离子迫害。通过对转基因植株的检测,发现其中株大麦的基因表达量与耐铝小麦基因的表达量相同。并且这株转基因大麦在含有高浓度铝离子的土壤中表现出很强的抗铝胁迫能力,生长势良好。同时,等还发现成功转入基因的大麦植株吸收土壤中磷离子的能力显著增强。等在小麦中发现了极为重要的两个/转录因子和并采用农杆菌介导法将其分别转入大麦,在干旱的实验环境下,转基因株系的生长状况明显要优于对照株系。并且后续实验显示转基因大麦中过量表达的和可以显著提高植株的抗寒性。抗冻基因表达载体的构建及遗传转化

24、研究.大麦品质改进应用大麦的品质对啤酒酿造和动物饲料的生产至关重要,随着饲料产业的快速开展及啤酒工业的需求增加,大麦品质改进已成为大麦育种的重要目标之一。其中利用转基因技术从植物、细菌或动物细胞中别离具有重要价值、有益健康的目的基因转移到大麦中去,以改善原有的品质特性,使农作物产品成为健康食品、功能食品和营养食品,因此它是改进品科,培育高产、优质、高抗性农作物新类型和新品种的有效途径。蓝色黑鸭草 中的基因是硫氧还蛋白基因家族中的一员,其表达产物可增加淀粉酶和蛋白质酶的活力,还可以促进贮藏蛋白的水溶性和增强营养物质的分解等功能。刘雷等通过基因枪介导法将基因导入大麦幼胚,得到转基因大麦植株,并对转

25、基因植株代进行淀粉酶的活性检测,得到的结果显示在发芽天的大麦种子中,成功转化的植株其淀粉酶活性相对于对照植株显著提高。卫丽禾用基因枪介导法成功将基因转化到啤酒大麦品种中,在对转基因后代酶活性的分析中发现,发芽天的种子中【.淀粉酶和.淀粉酶的活性比对照高.%,并且外源基因还可以提高大麦中.氨基酸和可溶性氮的含量,改善糖化率等功能。锌离子对作物的产量和营养价值至关重要,通过转基因方法可以促进大麦对土壤中锌离子的吸收。等在拟南芥中发现了锌运输载体基因并采用农杆菌介导法将其转入大麦品种中,通过对后代转基因大麦的生理检测发现,在基因过量表达的植株中,锌元素摄取速度比对照显著提高,并且大麦籽粒锌含量也比对

26、照高。为促进单胃动物如家禽对营养物质的吸收,通常在饲料中参加一定比例的木聚糖酶和一葡聚糖酶以改善饲料的品质。由于品质改进相关基因的发现,通过转基因方法可将其转入大麦的胚乳细胞并过量表达可以长期稳定储存的相关酶类,改善饲用大麦的品质。等采用农杆菌介导法将一种杂合的热稳定,.葡聚糖酶基因.转入大麦 品种中,在后代的籽粒中,.葡聚糖酶以及,.,.葡聚糖酶的活性比非转基因植株明显增强,并且籽粒中酶蛋白活性因产物具有极高的酶催化活性。等采用农杆菌介导法将来源于真菌的木聚糖酶基转入大麦,在代转基因植株中木聚糖酶的表达量持续稳定,其最高酶活性比非转基因株系的酶活性高出倍,而且木聚糖酶在高温条件下仍具有极高的

27、酶活性,在长期储存后种子中木聚糖酶活性仍然稳定。植物抗冻基因工程研究进展随着耕地面积的减少,以及人口的快速增加,粮食作物的需求量越来越大,扩大种植面积和增加单产是解决粮食压力的有效途径。在我国的北方地区,由于低温造成的冷害和冻害会限制作物的增产并且显著降低了作物的品质,在灾情严重的地区往往会造成作物大规模的减产或绝收,而通过转基因技术将外源抗冻基因转入粮食作物可有效提高作物的抗冻性并扩大了作物的种植区域和面积,是作物抗冻新品种选育的有效途径。随着各种类型的抗冻基因不断的被开掘和利用,促进了作物抗冻育种的开展。.抗冻基因的来源抗冻基因的来源广泛,近年来的研究成果说明,许多与抗冻相关的基因普遍存在

28、于各种生物体内,如鱼类、昆虫、植物、微生物等。抗冻基因最初是从鱼类中发现的,鱼类抗冻蛋白从结构上可分为多种类型谢秀杰,。比目鱼中的基因等表达一种抗冻蛋白可以有效阻止生物体内冰晶的形成,年,人利用农杆菌介导法将其转入番茄中,结果说明转基因番茄抗冻能力得到增强,其组织提取液具有极强的冰晶抑制能力。在随后的研究中,科研人员在一些昆虫体内发现抗冻基因,而且与鱼类和植物相比,昆虫抗冻蛋白的活性高,从黄粉甲和云杉卷叶蛾等昆虫中筛选和别离的抗冻基因其表达产物抗冻能力往往是鱼类中相应基因的百倍以上赵干,。等在蚜虫中发现了基因,将其与启动子连接并采用农杆菌介导法转化烟草中,在基因稳定表达的后代转基因植株中,组织

29、液的冰晶抑制能力显著增强。目前在昆虫中已经提取出多种抗冻基因。植物抗冻基因工程近年来开展迅速,目前已从菠菜、大麦等植物中发现多种抗冻基因李璐,。等在胡萝卜中发现一个基因并构建了表达载体,抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究通过农杆菌介导法将其转入烟草中,对转基因后代进行冻害处理,发现其抗冻能力明显高于非转基因烟草。.抗冻基因的应用近年来,研究人员在多种生物体内发现了许多功能各不相同的抗冻基因,随着转基因技术的快速开展,这些基因得到了不同程度的利用,已成为作物抗冻育种的一种有效途径,促进了农业的开展。.抗冻蛋白基因抗冻蛋白.,可以显著提高生物体内组织液抑制冰晶形成的能力,提高其抗冻性。抗冻蛋白最

30、早是在鱼类中发现的,随后在植物和昆虫等生物体内也发现和别离了抗冻蛋白.,; .,并得到了其基因序列。抗冻蛋白由于其强大的冰晶抑制能力,一经发现就得到了科学家们的重视,而且大局部抗冻蛋白是由单基因控制,特别适合采用转基因技术对其加以利用,目前,已有多种抗冻蛋白基因得到别离和克隆并将其应用于作物的抗冻育种中去。等将鱼类基因整合构建到高效表达载体上,通过农杆菌介导法将其转入花卉、烟草、油菜等,获得了一定的抗冻能力。等人工合成了一段基因,与启动子连接后转入马铃薯中,对转基因后代进行表型鉴定和基因表达水平鉴定,发现基因表达量越高的植株其抗冻害的能力越强。等发表了胡萝及其基因,从而改变了长期以来人们只能应

31、用源于鱼类的基因来从事植物的抗冻基因工程研究状况,为植物抗冻基因工程研究开辟了新的道路。黄永芬等将源于昆虫拟蝶中的抗冻蛋白基因采用花粉管通道法将其转化番茄中,转基因植株在低温下的生长势明显优于对照。.脯氨酸基因脯氨酸是植物蛋白质的组织成分之一,并可以游离的状态分布于植物的组织液中,在干旱、盐渍、低温等环境胁迫下,植物体内会积累大量的,其可协助植物抵抗上述胁迫的压力。亲水能力极强,可稳定原生质胶体及组织内的代谢华中农业大学届硕士学位毕业论文过程,从而降低植物组织液的凝固点,防止植物细胞脱水,提高了植物的抗冻抗寒能力。等将转基因的拟南芥放置于极低的温度下,经过长时间的冻害处理,非转基因的植株全部死

32、亡而转基因的植株存活。年,基因整合到质粒,采用农杆菌将其转化到落叶松,目的基等人将因稳定表达的植株中的含量明显增加,且转基因植株的抗冻能力也随之增强。.脂肪酸去饱和酶基因大量的研究成果说明,植物细胞膜在低温处理下其通透性会发生变化,特别是当温度在以下时,植物细胞膜液晶状态逐渐变为凝胶状态,细胞膜的生物活性降低,进而致使植物的新陈代谢紊乱,阻碍植物的正常生长。如果在植物细胞膜中添加不饱和脂肪酸的比例,可以促进低温下植物细胞膜液晶状态的稳定,防止细胞膜固化,提高植物的抗冻性。近年来,脂肪酸去饱和酶相关基因不断的被发现被予以利用,得到了具有积极意义的成果。年,等人在拟南芥叶绿体中发现并别离了一种脂肪

33、酸脱氢酶基因并将其导入烟草中,后代转基因植株的抗冻性提高。.超氧化物歧化酶基因植物在低温条件下,其细胞膜的稳定性变差,细胞内活性氧的含量增加,导致细胞膜功能下降,结构破坏,影响植物的正常生长与发育。而超氧化物歧化酶简称可去除活性氧,维护膜系统稳定性。超氧化物歧化酶是生物体内重要的抗氧化酶,分布及其广泛,从人类到单细胞生物,他都普遍存在。可抵抗与阻断因氧自由基对植物细胞的损害,并可修复受损细胞,而且还是生物抗氧化机制中重要核心酶。自从发现在植物中的抗冻作用以来,研究人员就致力于发现、别离、克隆基因并应用于作物抗冻育种中去,特别是对于一些冷敏感的作物,有着积极的意义。等与等分别在烟草与拟南芥中发现

34、并克隆了基因,并将其转化到冷敏感植物中,得到的转基因植株都具有明显的抗冻性。大量的研究说明在转入基因的植物中,转化柱的抗冻能力都得到了提升,主要是由于基因的表达产物减少了活性氧对植株的损害。程焉平,抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究基因具有广阔的应用前景。但目前超氧化物歧化酶基因转化过程中还存在诸多问题,工作机制仍不明确,还需要进一步的研究。研究的目的意义大麦是啤酒酿造的主要原料,同时也是动物饲料的重要成分,随着啤酒工业和饲料产业的迅速开展,大麦的需求量也极度扩大,但目前的大麦产量远远不能满足社会需求,特别是在中国耕地面积逐渐减少的情况下,提高大麦的单产尤为重要。随着人类对自然环境的破坏以及

35、气候的异常变化,作物的生长环境也趋于恶劣,干旱、涝害、冻害、冷害等自然灾害时常发生张国存等,。大麦冻害是一种常见的自然灾害,在全球范围内普遍发生,;,在我国北方地区常常会发生“倒春寒现象,对大麦的生殖生长造成损害。本试验通过对南极鱼类的超氧化物歧化酶基因基因转化大麦的研究增强大麦品种的抗冻性。华中农业大学届硕士学位毕业论文第二章 大麦幼胚再生体系的建立材料和方法.材料试验选用的大麦品种有美里黄金 ,以及本实验、室育成的华大麦号、华大麦号共个基因型,种植于华中农业大学试验田。.培养基?. .诱导培养基:无机./ /酸水解酪/ /麦芽糖. /蛋白.肌醇.脯氨酸. 。?. .继代培养基:无机./ /

36、 /酸水解酪/蛋./肌醇.脯氨酸/ 麦芽糖. 。分化培养基:无机去掉其中 / ./. .。./ /肌醇.脯氨酸. /麦芽糖. /。.生根培养基:无机./酸水解酪蛋白./肌醇.脯氨酸朗麦芽糖. / 。所有培养基调至.,.高压湿热灭菌分钟。脯氨酸、过滤除菌后参加已灭菌培养基。培养基不可重复加热融化。大麦愈伤组织的诱导、继代培养、分化及植株再生在个大麦品种开花后.时收集穗子,去麦芒及颖壳,用%乙醇消毒,.%升汞消毒,无菌水冲洗.次,期间要不停的摇晃三角瓶使大麦在消毒和冲洗时均匀充分。用镊子和解剖刀将幼胚剥离,盾片朝上接种于诱导培养基上。放置在的条件下暗培养以诱导愈伤组织,形成的愈伤组织每隔转移到新鲜

37、继代培养基继代一次。幼胚愈伤组织培养到适宜的大小时,将其转入分化培养基中进行绿苗分化,光照条件下培养。当分化出的小苗长至时,将其转移到抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究生根壮苗培养基上。待生成新根,并长成一个完整的植株后叶心,敞开瓶口,参加少许水,炼苗,洗去根部的培养基,将苗移栽到营养钵中。结果统计及分析.统计方法出愈率%出愈的幼胚总数/接种的幼胚总数×%分化率%分化绿苗数/接种的愈伤总数×%发芽率%幼胚发芽数/接种的幼胚总数×.幼胚愈伤组织的诱导与再生大麦幼胚在诱导培养基中进行培养,开始时所诱导的愈伤组织质地松散,水分较多,需要进一步培养成分化能力强的胚性愈伤

38、图.,此过程需要周的时间,期间培养基需周更换一次。将长势良好的胚性愈伤转接到分化培养基上,两周后,大局部愈伤组织形成绿芽图.,再经过周左右的光照培养,叶片长至至厘米时,便可转移至生根培养基中进行培养图.。再生苗长至适宜的大小时,经过驯化,便可移栽至营养土中培养并结实。华中农业大学届硕士学位毕业论文.?:幼胚愈伤组织:分化出绿芽:生根的绿苗:再生植株: :.不同基因型对幼胚愈伤组织诱导及分化的影响实验中研究了不同基因型对大麦幼胚愈伤组织诱导率的影响,由表.可知,所选大麦各个品种都表现出较高的愈伤组织诱导率和分化率,其中对照品种拘诱导率和分化率都最高,个试验品种的愈伤组织诱导率都达至%以上。特别是

39、华大麦号、华大麦号均表现出极强的诱导率;在所选品种愈伤组织分化率方面,美里黄金和华大麦号到达以上%。华大麦号的分化率低于其他品种。个品种都具有极好的愈伤组织诱导率和分化率,是良好的大麦遗传转化受体。抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究表不同基因型愈伤组织诱导率及绿苗分化率品种平均出愈率% 平均分化率%. .美里黄金. .华大麦号. .华大麦号.对幼胚愈伤组织诱导的影响在愈伤组织诱导过程中,在培养基中添加可有效抑制幼胚直接发芽,促进愈伤组织的形成。本实验通过在诱导培养基中添加不同浓度的,统计在各种浓度下幼胚的生长及分化情况,找出最适宜的配比,并应用于大麦再生体系的建立。实验中所采用的浓度为.,并

40、统计前两周三个不同基因型的幼胚诱导率及发芽率,结果见表.。结果显示,在未添加的诱导培养基中,幼胚极易发芽并严重影响了愈伤组织的诱导。随着浓度的增加,抑制幼胚直接发芽的能力逐步增强,但是在高浓度的诱导培养基中,幼胚诱导的愈伤组织生长缓慢,诱导率有所下降。从得到的数据中发现,./的浓度未显著影响幼胚愈伤组织的诱导率及其生长速度,并有效抑制了幼胚直接发芽。表:诱导培养基中浓度对大麦幼胚愈伤组织诱导的影响:品种 浓度 接种数 出芽数 出芽率 出愈数出愈率朗 .% .%.% .%.% .%.% .% .% .%华大麦号.% .%.% .%. %.% .% .%华大麦号.% .%.% .%.% .%华中农

41、业大学届硕二匕学位毕业论文第三章基因表达载体的构建与遗传转化实验材料与方法.材料质粒:载体,?实验室改造,命名为菌种:感受态大肠杆菌实验室自备,根瘤农杆菌实验室自备。植物品种:,美里黄金 ,华大麦号,华大麦号,种植于华中农业大学试验田。限制性内切分子试剂:反响所用试剂、和酶、连接酶以及 均为公司生产。胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为天根公司生产。.实验方法.基因表达载体的构建,在的根底上改造,在过表达的根本载体是和 之间参加了终止区。和 之间参加了启动子,图载体图谱. 抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究.基因表达载体构建策略首先,以载体上的目的基因为模板,用方法扩增出目的片段;回收后与 载体连

42、接后测序,并双酶切连接有目的片段的载体,随后将再次回收的目的片段和同样酶切后回收的载体片段用连接酶连接;利用法制备新鲜的大肠杆菌感受态,再用热击法将连接产物转入大肠杆菌,提取质粒,经酶切验证筛选得到含有目的基因的重组质粒,命名为;然后用电击法将构建好的表达载体转的农杆菌菌入农杆菌中;验证,获得带有重组质粒株。.引物设计与反响条件试验所用引物根据基因序列设计,正向引物端添加了酶切位点,反向引物端添加了 酶切位点。正向引物为: .:.反向引物为:反响体系:成分 参加量模板./ / “各/.酶/ .无菌双蒸水补至总体积华中农业大学届硕士学位毕业论文反响程序:.割胶回收目的片段片段的回收,使用天根割胶

43、回收试剂盒,具体方法如下柱平衡步骤:向吸附柱中吸附柱放入收集管中参加微升平衡液,.离心分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放入收集管中。将单一的目的片段条带从琼脂糖凝胶中切下尽量切除多余局部放入干净的离心管中,称取重量。向胶块中参加倍体积的溶胶液。水浴放置分钟,期间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块,可以补加一些溶胶液或继续放置几分钟,直至胶块完全溶解。将上一步所得溶液参加一个吸附柱中吸附柱放入收集管中,室温放置分钟,.离心至秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中参加微升漂洗液,.离心至秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中参

44、加微升漂洗液,.离心至秒,倒掉废液。将吸附柱放回收集管中,.离心分钟,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温数分钟,晾干,防止残留的漂洗液影响下一步的实验。将吸附柱放到一个干净的离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量的缓冲液,室温放置分钟,.离心分钟收集溶液。抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究回收得到的片段可用琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。.载体的连接在微量离心管中参加以下溶液,全量为。 一 割胶回收产物双蒸水“反响分钟。.法制备大肠杆菌感受态细胞质粒繁殖的受体菌株采用.工程菌。接种单菌落.?于 液体培养基中,。条件下培养过夜;按:将过夜培养菌液接种于 液体培养基中,。条件下培养至&#

45、168;为.;将菌液分装于.无菌离心管中,冰浴分钟,。条件下离心分钟收集细胞;菌体重悬浮于预冷的溶液中,。条件下离心分钟收集菌体,弃上清液:注:溶液含有/ 的和体积为%的甘油,用调至.。菌体重悬浮于 预冷的溶液中,冰浴分钟,温度下离心分钟收集菌体;每管菌体沉淀用.预冷的溶液重悬浮,立即冻存于一。注:该方法制备的感受态细胞比常规方法转化效率提高.个数量级,可达转化体/。.质粒向大肠杆菌的转化事先将恒温水浴锅温度调至。:华中农业大学届硕士学位毕业论文将一管.感受态细胞握在手上使菌液迅速融化后插入冰上,冰浴.;参加质粒,轻轻震荡混匀,冰置分钟;轻轻摇匀后插入水浴中热激.分钟,迅速置于冰上冷却.分钟;

46、培养液不含,。摇床振荡培养分参加.钟;取菌液均匀涂布于含抗生素的平板上,。倒置培养小时:挑选白色菌落,确认载体中插入片段的长度大小。.测序保存菌种,寄出菌液,由安基生物公司提供测序效劳。.质粒提取:的平柱平衡步骤:向吸附柱中吸附柱放入收集管中,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新衡液, 离一放回收集管中。请使用当天处理过的柱子取.过夜培养的菌液参加离,管中, 离心,尽量吸除上清。向留有菌体沉淀的离一管中参加 溶液请先检查是否已参加,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。向离一管中参加.溶液,温和地上下翻转次使菌体充分裂解。注意:温和地混合不要剧烈震荡,以免污染基因组。此时菌液应变得清亮粘稠,

47、所用时间不应超过 ,以免质粒受到破坏。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。向离管中参加此溶液,立即温和地上下翻转?次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。 ,此时在离,管底部离,形成沉淀。将上一步收集的上清液分次参加过滤柱过滤柱放入收集管中,小心地将离,后收集管中得到的溶液分次参加离心抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究吸附柱中吸附柱放入收集管中,如果过滤柱中有剩余的液体说明步骤吸取的上清中杂质过多,可以延长离心的时间;如果离心后收集管底部有少量的沉淀.尽量地吸取上清。,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放离心入收集管中。,向吸附柱中参加去蛋白液,离心倒掉收集管中的废液,将吸附

48、柱放入收集管中。向吸附柱中参加漂洗液请先检查是否已参加无水乙醇,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集离心管中。注意:参加漂洗液后,如果室温静置. ,有助于更好地去除杂质。,向吸附柱中参加漂洗液,离心倒掉收集管中的废液。,将吸附柱重新放回收集管中置于离心目的是将吸附柱中剩余的漂洗液去除。将吸附柱自科置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加将.洗脱缓冲液,室温放置 ,离心质粒溶液收集到离心管中。得到的质粒可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带,也可能为到条条带,这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。.质粒酶切与连接将提取的 质粒和含有目的片段

49、的质粒分别用和进行双酶切,均采用如下体系:成分 体积 ×质粒双蒸水华中农业大学届硕士学位毕业论文。反响过夜,琼脂糖凝胶电泳检测并回收条带。回收方法见.的片段连接采用目的基因片段和载体采用体系,方法如下:在微量离心管中参加以下连接反响液。× 片段载体肛肛反响过夜,直接用于大肠杆菌感受态的转化。转化方法见.。由于的琼脂平板载体是卡那霉素抗性,因此,最后菌液涂于含有/培养基上,倒置培养。.载体的构建通过对.中平板单克隆的摇菌和菌液鉴定,以及提取质粒进行和 双酶切鉴定,确定得到含有目的片段的质粒,保存质。粒,命名为.农杆菌介导的大麦遗传转化大麦遗传转化的方法主要来自于等仓建和等以及等修改的方法。.大麦组织培养过程中的培养基制备/双丙胺膦.电转化农杆菌感受态细胞的制备的平板上划线培养,。,;农杆菌在含有/抗冻基因表达载体的构建及遗传转化研究挑单菌落接种于含有/ 的液体培养基中,。,震荡培养过夜;将菌液转移至含有/ 的液体培养基中,。,震荡培养至.左右;将菌液分装于离心管中,冰上处理分钟,。,离心,弃上清。用预冷的无菌水重悬,。,离心,弃上清并重复清洗.次;弃去上清,用预冷的%甘油重悬,用枪头吸打均匀之后,以的规格分装于灭菌.离心管,并放入.保存。.质粒转化农杆菌在冰上解冻电感受态细胞,添加.质粒,用枪吸动混匀;将细胞混合物转移至冷却后的电转化池中;液体培养基,